Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) accorder # 1R21MH085267.

Partie 1: Préparation d&#39;un moule maître pour le multi-compartiment de fabrication de neurones périphériques de co-culture <ol><li> Première étape pour fabriquer le maître PMMA est de faire de 3,5 mm compartiments profonds. Un compartiment soma et six axone / glie compartiments sont définies sur un bloc de PMMA en utilisant une machine de fraisage une micro-(MDX-40, Roland ou tout autre fraiseuse CNC). PMMA maître est ensuite soniquée dans l&#39;alcool isopropylique pendant 10 minutes pour enlever les débris. </li><li> Des tableaux de structures um 2,5 haute crête sont modelés sur un mm 50,8 x 50,8 mm lame de verre par un procédé de photolithographie standard, suivi par gravure humide du verre. Tout d&#39;abord, tableau de structures dorsale sont calqués sur un substrat de verre nettoyé avec positifs résine photosensible S1818 en utilisant la photolithographie. S1818 est spin-enduit sur ​​le substrat (4000 rpm), douce basée à 110 ° C pendant 5 min, puis exposé à la lumière UV (84 mJ / cm 2) en utilisant un masque de aligneur suivie par l&#39;élaboration de la résine dans le MF319 pour 40 secondes. Ensuite, le substrat photorésine verre imprimé est immergé dans de l&#39;oxyde tamponné etch (BOE) à température ambiante pendant 6-7 minutes pour obtenir un 2,5 um structures dorsale haute. Enfin, la couche de résine est enlevé par de l&#39;acétone et l&#39;alcool isopropylique, suivi d&#39;un rinçage complet en dé-ionisée (DI). </li><li> Substrat en verre avec des micro-structures dorsale est chaud-relief contre le maître de PMMA de transférer ses habitudes. Premièrement, le maître moule PMMA et des substrats de verre sont alignés manuellement et placés sur une presse à chaud. Ensuite, la température est élevée à 115 ° C. Une fois la température souhaitée est atteinte, 0,5 tonnes de poids est appliqué pendant 5 minutes. Après 5 minutes, la température est abaissée à 40 ° C et la pression est relâchée. Le maître de PMMA est ensuite découpé en mm 50,8 x 50,8 mm taille du bloc. </li><li> PDMS pré-polymère (Sylgard 184) est mélangé avec l&#39;agent de durcissement au ratio de 10: 1 en poids. </li><li> PMMA maître est placé à l&#39;intérieur un tonneau et le mélange PDMS est versé sur le dessus du maître PMMA pour fabriquer un maître PDMS. Il est ensuite placé dans un dessiccateur reliée à une pompe à vide. PDMS versé sur le dessus de PMMA maître est ensuite dégazée pendant 15 minutes pour enlever les bulles générées pendant le processus de mélange PDMS. </li><li> Lorsque toutes les bulles sont éliminées, le PDMS est mis à l&#39;intérieur d&#39;un four nivelé 85 ° C pendant une heure pour la polymérisation. </li><li> Une fois PDMS est complètement durci, le PDMS maître est décollée du maître PMMA et placé dans un dessiccateur avec 2-3 gouttes de trichlorosilane et l&#39;aspirateur pendant 15 minutes à la vapeur recouvrir la surface de PDMS maître. Revêtement Trichlorosilane facilite la libération de la finale de PDMS neurone de co-culture des dispositifs du maître PDMS. Après le revêtement, le maître de PDMS est brièvement rincée avec de l&#39;alcool isopropylique pour enlever trichlorosilane excessive, et séché avec gaz N 2. </li></ol> Partie 2: réplication Neuron dispositif de culture <ol><li> PDMS pré-polymère (Sylgard 184) est mélangé avec l&#39;agent de durcissement au ratio de 10: 1 en poids. </li><li> Mélange de PDMS est versé sur le dessus du maître PDMS et dégazé dans un dessicateur relié à une pompe à vide pendant 15 minutes. Il est important de ne pas verser trop de PDMS afin que les 3,5 mm sur la structure de haut PDMS le maître n&#39;est pas complètement immergé. </li><li> Lorsque toutes les bulles sont éliminées, le PDMS est mis à l&#39;intérieur d&#39;un four nivelé 85 ° C pendant une heure pour la polymérisation. </li><li> PDMS est sorti du four après une heure et laissé à température ambiante pour refroidir. Ensuite, les dispositifs en PDMS la culture de neurones sont délicatement décollée du maître PDMS. Peler les dispositifs en PDMS sont enveloppés avec du parafilm pour les protéger des poussières ou des débris. </li><li> Appareils PDMS, enveloppé avec du parafilm, sont coupés en morceaux individuels à l&#39;aide d&#39;une perceuse équipée d&#39;une lame. </li></ol> Partie 3: Dispositif de montage <ol><li> Dispositif de PDMS la culture de neurones est placé à l&#39;intérieur du filtre plasma et exposé à l&#39;air du plasma pendant 90 secondes pour rendre la surface de l&#39;appareil PDMS hydrophile. Ce traitement par plasma facilitera microcanaux à être rempli de milieux de culture après le montage à la poly-D-lysine substrat enduit. </li><li> Périphériques traités avec du plasma sont ensuite plongées dans de l&#39;éthanol 70% pendant 30 minutes pour la stérilisation et déplacé à l&#39;intérieur du capot de la bio-stérilisés. </li><li> Appareils stérilisés sont prises à partir d&#39;éthanol à 70% et séché avec Millipore filtrée gaz N 2. Appareils secs sont placés sur le dessus de la poly-D-lysine en polystyrène recouvert de 6 puits plaque de culture et une légère pression est appliquée pour assurer l&#39;étanchéité entre le substrat et le périphérique. </li><li> Milieux de culture est ensuite introduit dans le compartiment soma, suivie d&#39;un remplissage des six axone / glie compartiments. Il est préférable de donner 1-2 minutes de pause avant de remplir axone / glie compartiments après l&#39;ajout de milieux de culture pour le compartiment Soma pour s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle sont piégés dans les microcanaux. </li><li> Périphériques rempli de milieux de culture est incubée au sein d&#39;une pépinière à 37 ° C durant la nuit pour se rincer les débris possibles ou de résidus toxiques. </li></ol> Partie 4: Chargement des cellules et des neurones-oligodendrocytes de co-culture <ol><li> Le premier jour de la culture cellulaire, des cellules primaires de neurones du cerveau antérieur du jour embryonnaire 16-18 rats sont chargés dans le compartiment le soma à une densité surfacique de 500 cellules / mm 2. Tout d&#39;abord, les milieux de culture à l&#39;intérieur du compartiment à la fois soma et axone / glie compartiments sont aspirées à l&#39;aide la pipette avant le chargement de la cellule. Puis, les cellules 38500, diluée dans 40 pl de milieu de culture, sont chargés dans le compartiment autour du soma entrées microcanal. Il est important de ne pas toucher l&#39;appareil pendant le chargement des PDMS cellules, car elle peut briser l&#39;étanchéité entre le dispositif et le substrat. </li><li> Incuber les cellules périphériques chargés pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 ° C pour améliorer l&#39;adhérence des cellules au substrat. Après incubation, tous les compartiments sont remplis de milieux de culture. </li><li> Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 incubateur et seulement la moitié des milieux de culture est changé sur tous les 3-4 jours. </li><li> Après 14 jours de culture in vitro de neurones, les oligodendrocytes sont ajoutés aux compartiments axone / glie pour la co-culture. Oligodendrocytes, disséqué par les hémisphères cérébraux des rats Sprague-Dawley au jour postnatal 1-2, sont ajoutés à chaque compartiment axone / glie à une densité surfacique de 1000 cellules / mm 2. Avant de cellules de chargement, environ 60% des milieux de culture dans les compartiments sont aspirés avec pipette. Attention doit être fait de ne pas toucher le substrat du fond, car il peut endommager le réseau des axones formés sur le substrat. Puis, 6700 oligodendrocytes, dilué dans 5 ul de milieux de culture, sont ajoutés aux compartiments axone / glie. Les cellules sont incubées pendant 1 heure et compartiments sont remplis avec des milieux de culture. </li><li> Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 incubateur et seulement la moitié des milieux de culture est changé tous les 3-4 jours à deux semaines de plus. </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Lorsque les expériences sont menées correctement, les cellules neuronales chargé pour le compartiment Soma localiser près de criques à microcanaux et la couche axonale commencent à se former à l&#39;intérieur du compartiment axone / glie après 1 semaine de la culture. Signe de l&#39;agrégation cellulaire des neurones à l&#39;intérieur du compartiment à Soma peut être une indication que les cellules ne sont pas sains. Lors du chargement des oligodendrocytes, après deux semaines de culture neurone, axone / glie compartiments doivent être couverts d&#39;une couche dense de axones et des oligodendrocytes doivent être chargés sur le dessus de la couche d&#39;axonal. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. Illustrations schématique de la microfluidique à haut débit multi-compartiments du SNC neurone plateforme de co-culture. Vue en coupe montrant l&#39;isolement des axones neuronaux du soma et des dendrites ainsi que l&#39;isolement fluidique entre compartiments avec différence de niveau minute fluidiques. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figure 2" /> Figure 2. Fabrication et étapes de montage pour le compartiment multi-PDMS microfluidique dispositif de co-culture. Chaque périphérique s&#39;intègre dans un puits d&#39;une classique 6-même plaque de culture cellulaire polystyrène. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol>
	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous avons développé un compartiment multi-plateforme de co-culture pour l&#39;étude des mammifères SNC axone-glie interaction. Axones du SNC ont été correctement isolé de cellules neuronales organismes / dendrites, et les oligodendrocytes ont été co-cultivées avec succès à l&#39;intérieur du dispositif. La densité des neurones peut être modifiée par les applications, mais la concentration trop faible ou trop élevé peut provoquer la mort des cellules. Aussi, il est important de changer seulement la moi...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

Nous présentons une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture dans la recherche in vitro l&#39;interaction du système nerveux central axone-glie, capable de conduire jusqu&#39;à six expériences indépendantes en parallèle pour débit plus élevé. Nous avons développé un procédé de fabrication afin de créer de nouveaux dispositifs microfluidiques ayant structures à l&#39;échelle micro et macro dans le même dispositif à travers un simple processus de lithographie douce, permettant la fabrication de masse avec une bonne répétabilité. Le multi-compartiments microfluidique plateforme de co-culture est composé d&#39;un compartiment soma des neurones et six axone / glie compartiments pour les oligodendrocytes (OL). Le compartiment soma et axone / glie compartiments sont reliés par des réseaux de microcanaux de guidage des axones qui fonctionnent comme des barrières physiques pour confiner le soma des neurones dans le compartiment soma, tout en permettant aux axones de se développer en axone / compartiments glie. OL chargé dans l&#39;axone / glie compartiments peuvent interagir uniquement avec les axones, mais pas avec le soma des neurones ou des dendrites, permettant des études d&#39;interactions localisées axone-glie. Les microcanaux ont également permis l&#39;isolement fluidique entre compartiments, laissant six expériences indépendantes pour être menée sur un seul dispositif pour un débit plus élevé. Soft-lithographie utilisant le poly (diméthylsiloxane) (PDMS) est une technique couramment utilisée dans microdispositifs biomédicale. Réservoirs sur ces dispositifs sont communément définis par poinçonnage manuel. Bien que simple, un mauvais alignement et la nature du temps du processus rend ce processus ne convient pas quand un grand nombre de réservoirs doivent être reprises créé. La méthode nouvellement développée n&#39;exigeait pas la perforation manuelle de réservoirs, de surmonter ces limitations. Tout d&#39;abord, sept réservoirs (profondeur: 3,5 mm) ont été faites sur un poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) de bloc en utilisant une machine de fraisage une micro-. Ensuite, les tableaux de microstructures crête, fabriqué sur un substrat de verre, ont été à chaud en relief contre le bloc de PMMA de définir des microcanaux qui relient le soma et axone / glie compartiments. Ce processus a abouti à l&#39;échelle macro-réservoirs (3,5 mm) et micro-échelle des canaux (2,5 um) pour coïncider avec un seul maître de PMMA. Une réplique de PDMS qui a servi en tant que maître moule a été obtenue en utilisant lithographie douce et le dispositif final PDMS a été reproduite à partir de ce maître. Neurones primaires de rat E16-18 ont été chargés dans le compartiment soma et cultivées pendant deux semaines. Après une semaine de culture cellulaire, les axones traversé microcanaux et a formé des axones de la couche réseau seulement à l&#39;intérieur des axones / glie compartiments. Les axones a grandi de façon uniforme partout dans six axone / glie compartiments et LO de P1-2 rats ont été ajoutés à l&#39;axone / glie compartiments moins 14 jours in vitro pour la co-culture.

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform at JoVE.com

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu&#39;à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.

Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K vues.  Texas A&M University (TAMU). Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.

Vidéo: A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Recherche

Biologie

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Capturez cellule à l&#39;aide d&#39;un dispositif microfluidique

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

La sonde microfluidique: Fonctionnement et utilisation pour le traitement de surface localisé

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

L&#39;adhésion des plaquettes et l&#39;agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

Modification ES / OP9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de Progeny hématopoïétiques

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...