Este método podría ayudar a responder a problemas clave en los campos de virología y microbiología relacionados con la enumeración de bacteriófagos a partir de muestras complejas y diagnósticos y terapias basados en bacteriófagos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación eficiente y precisa del tiempo de un gran número de muestras de experimentos de biopanning de la pantalla de fagos no es factible con los ensayos tradicionales. Demostrando el procedimiento serán Rashmi Mohanty y Jasmim Leal, estudiantes graduados de mi laboratorio.
Después de diseñar las imprimaciones y crear una concentración de stock, obtenga ADN de fago T7 de referencia a una concentración de 0,1 microgramos por microlitro. Usando agua ultrapura, diluir en serie este ADN diez veces, de un millón de femtogramas por microlitro a un femtogramas por microlitro en tubos PCR de 0,2 mililitros. Preparar 20 microlitros de cada concentración, asegurándose de cambiar las puntas de la pipeta y el vórtice de los tubos entre cada etapa de la dilución.
A continuación, convierta la concentración de ADN de referencia de phage T7 de femtogramas por microlitro en copias del genoma por microlitro. En primer lugar, pipetear 200 microlitros del clon de fago T7 de muestra en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros para cada una de las 10 muestras deseadas. Agregue dos microlitros de DNase uno a cada tubo.
Tapa los tubos e incuba a 37 grados centígrados durante 10 minutos en un baño seco calentado. Luego incubar a 100 grados centígrados durante 15 minutos en un baño seco caliente. Centrifugar los tubos que contienen los fagos tratados térmicamente a 18, 534 veces g durante 10 segundos.
Coloque los tubos centrifugados en un mezclador de vórtice en modo de activación táctil durante 10 segundos para mezclar los fagos. Gire de nuevo a 18, 534 veces g durante 10 segundos. Después de esto, deje las muestras en el banco del laboratorio alrededor de una hora para enfriarlas a temperatura ambiente.
Preparar la premezcla qPCR para 10 muestras de fago biopanned de concentración desconocida y siete muestras de concentraciones estándar en triplicado. Resultando en una premezcla para 51 muestras que contienen 255 microlitros de mezcla maestra qPCR, 51 microlitros de imprimadores y 102 microlitros de agua. Aliquot ocho microlitros de la mezcla de PCR preparada en 51 pozos de una placa qPCR de 96 pozos.
A continuación, añada dos microlitros de muestras de fagos T7 tratadas térmicamente a cada uno de estos pozos, dispensando por debajo de la superficie de la premezcla qPCR. Con película adhesiva, selle la placa. Envuelva la placa en papel de aluminio para minimizar el blanqueo fotográfico por fluorescencia y luego proceda a ejecutar la placa en el equipo qPCR.
Configure las condiciones de ciclo y los ajustes de curva de fusión como se describe en el protocolo de texto. Después de ejecutar el qPCR, la gráfica de amplificación, la gráfica de curva de fusión y la gráfica multicomponente se analizan a partir de los datos sin procesar. La gráfica de amplificación indica si la amplificación de PCR de cada muestra es correcta o no.
La gráfica multicomponente representa la amplificación y la descomposición de la señal fluorescente a lo largo de los ciclos de amplificación. Mientras que la gráfica de la curva de fusión se utiliza para validar la especificidad de las imprimaciones, ya que cada producto PCR tiene una temperatura de fusión única. A continuación, la curva estándar se genera a partir del ADN de referencia.
Aquí se calcula que la eficiencia de amplificación es de 92,4% Datos representativos de un estudio qPCR se comparan entonces con el mismo fago que se cuantificó mediante un ensayo de placa de doble capa en el rango probado de 10 a 10 millones de copias del genoma por microlitro. Como se ve aquí, el número de fagos en la cuantificación qPCR es mayor que en el ensayo de placa. La repetibilidad del método qPCR representado por el coeficiente de varianza se considera que tiene valores que van desde 2.85 a 27.2%Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay numerosas consideraciones en el desarrollo y uso de qPCR para cuantificar con precisión los fagos, incluyendo el tratamiento cuidadoso y la preparación de muestras y calibración de equipos relevantes.
Siguiendo este método, se pueden realizar otras técnicas para enumerar partículas de fagos en una variedad de aplicaciones incluidas en biopanning in vivo, preparación de ADN de biblioteca de fagos y secuenciación de próxima generación y detección de fagos en muestras ambientales complejas. No olvide que los fagos se consideran riesgos biológicos en el laboratorio y las precauciones tales como equipos de protección personal, incluyendo guantes y abrigos de laboratorio, siempre deben usarse durante la realización del procedimiento.
