Esta obra fue financiada en parte por la Fundación Nacional de Ciencias de subvención MCB-0718846 y Defensa Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada Contrato N66001-12-C-4020 (a JDB). LAM fue financiado por una beca postdoctoral de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. La publicación de este artículo es patrocinado por Roche.

1. Preparar el ADN genómico de la levadura (gDNA) <ol><li> Preparar un stock de levadura Lysis Buffer 9 que contiene 50 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS al 1% (w / v), 2% de Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Como a partir del uso de material ~ 2 x 10 6 células, que normalmente corresponde a ~ 100 l de la cultura saturada de cepas de laboratorio del BY4741 10 de fondo. Las células cultivadas se recogen por centrifugación a 1000 xg durante 3 min a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 l de tampón de lisis de levadura y volver a suspender el sedimento celular con la pipeta. </li><li> Añadir ~ 300 l de ácido lavó perlas de vidrio de tal manera que el nivel de perlas es de aproximadamente 1 mm por debajo del nivel de la suspensión celular. </li><li> En una campana de humos añadir 200 l de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1). Tape el tubo de microcentrífuga y asegurarse de que no hay cuentas están atrapados entre la tapa y el tubo ya que esto dará lugar a fugas durante la agitación(Paso 1.6). Invierta 3 veces para mezclar y comprobar la tapa está cerrada. </li><li> Agitar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente usando un mezclador de sobremesa tal como un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugar a 20800 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 75 l de la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de etanol al 100%. Invierta 10 veces para mezclar. </li><li> Sedimentar las ADN por centrifugación a 20.800 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin desalojar el sedimento de ADN. Lavar el sedimento con 500 l de etanol al 70%. </li><li> Centrifugar a 20.800 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin desalojar el sedimento de ADN y aire secar el pellet con la tapa abierta hasta microcentrífuga exceso de etanol se ha evaporado, que es generalmente alrededor de 10 min. </li><li> Resuspender el sedimento de ADN en 75 l de 10 mM Tris pH 7,4 y agitar para mezclar. Conservar la muestra a -20 ° C indefinidamente. Medir la concentración de ADN en la muestra utilizando unabenchtop fluorímetro como el qubit, que distingue el ADN a partir de ARN. Asegúrese de que la concentración final de ADNg es ~ 1.2 ng / l. </li><li> Preparar una dilución 1:10 de ADN genómico utilizando agua y agitar para mezclar. </li><li> Alícuota de 30 l de gDNA diluida en el pocillo apropiado de una placa de fuente que es compatible con un dispensador de líquido acústica nanoescala (paso 3). Si se utiliza un Labcyte Echo 550, utilice una placa de polipropileno de 384 pocillos (placa 384PP). NOTA: Cuando sellada apropiadamente este plato se puede almacenar durante al menos un mes a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparar y dispensación qPCR Master Mix en una placa de múltiples pocillos 1536 <ol><li> Preparar 850 l de mezcla maestra qPCR, como LightCycler 1536 ADN Verde Maestro, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agitar para mezclar. Centrifugar la mezcla maestra qPCR durante 2 min a 20.800 xg a temperatura ambiente para eliminar cualquier burbuja. Los componentes de la mezcla maestra qPCR requerido para una sola placa de múltiples pocillos 1536 son los siguientess: <ol><li> Combine 170 l de mezcla maestra enzima (Maestro Verde Tubo 1, 5x concentrado), 42,5 l de SYBR (Tubo Maestro Verde 4, 20x concentrado), y 637,5 l de agua. </li></ol></li><li> Dispensar 500 nl / pocillo en una placa de múltiples pocillos 1536 usando un dispensador de líquido a granel tal como el Art Robbins Cobra. (Tenga en cuenta que los pasos 2.2.1-2.2.4 se refieren específicamente a la Cobra.) <ol><li> Crear un programa de dispensación con los siguientes valores: clase de líquido, el agua; volumen aspirado, 800 l; dispensar el volumen, 500 nl; tiempo de lavado, 20 seg. En la configuración de dispensación, compruebe la velocidad de dispensación se ajusta a 49,6 mm / seg, el desplazamiento de dispensación es 0,25 mm, y el exceso de líquido aspirado se dispensará de nuevo en la fuente bien. </li><li> Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla maestra qPCR en pocillo A1 del soporte del tubo de microcentrífuga, que se encuentra en la posición de la cubierta 1. Cortar la tapa del tubo de microcentrífuga o simplemente dejarlo abierto. Ajuste el &#39;Aspirar bien &quot;a A1 editando el Aspiratconfiguración e. </li><li> Realice una etapa de lavado antes de la dispensación mezcla maestra qPCR por los primeros pasos de-seleccionar el aspirado y prescindir del programa creado en el paso 2.2.2 y luego golpear &#39;run&#39;. Una vez completado, vuelva a seleccionar el aspirado y dispensar pasos antes de ejecutar el programa completo para dispensar mezcla maestra qPCR. Si la Cobra se ha sentado inactivo durante menos de 10 minutos de la etapa inicial de lavado, que sirve para cebar el sistema, es innecesario. </li><li> Hit &#39;run&#39; para dispensar mezcla maestra qPCR a cada pocillo. </li></ol></li><li> Recoger la mezcla maestra qPCR en la parte inferior de cada pocillo mediante una breve centrifugación de la placa de múltiples pocillos 1536 (30 seg usando un de baja velocidad PCR placa spinner). </li></ol> 3. ADN y cebadores en el 1536 multipocillos placa de la plantilla de dispensación <ol><li> Prescindir de 5 nl diluida gDNA (paso 1.3) en los pocillos deseados de la placa de múltiples pocillos 1536 utilizando un sistema de transferencia de líquido acústico, como el Echo 550. <ol><li> Para el Echo 550, utilice el software de formatear la Plata o bien proporcionar una hoja de cálculo Excel personalizada para programar la transferencia. Asegúrese de que la fuente seleccionada también para el gDNA en el programa coincida con la fuente y en la que ha dispensado físicamente el gDNA (paso 1.3). Seleccione el tipo de placa de fuente &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, lo que indica que el líquido en la placa 384PP es un tampón sin surfactantes. </li></ol></li><li> Dispense 10 nl de cebadores, pre-mezclado adelante y atrás a una concentración final de 50 mM cada uno, en los pocillos deseados de la placa de múltiples pocillos 1536 utilizando un sistema de transferencia de líquido acústico, como el Echo 550. <ol><li> Para el sistema de transferencia de líquido, utilizar el software de reformateo Plate o bien proporcionar una hoja de cálculo Excel personalizada para programar la transferencia. NOTA: Aquí es posible prescindir de cebadores de tal manera que el diseño de la placa de múltiples pocillos 1536 coincide con el orden cromosómico de los cebadores por lo que es fácil de inspeccionar visualmente los resultados de la PCR en tiempo realdespués (paso 6). </li><li> Piensos compuestos los cebadores en una placa que es compatible con el dispensador de líquido acústico. Para el Echo 550, utilice una placa Labcyte 384LDV (bajo volumen muerto) y elegir el tipo de placa fuente &#39;384LDV_AQ_B&#39; al programar el Echo para indicar que el líquido es un buffer simple sin proteínas. </li></ol></li></ol> 4. Sello y Centrifugar el 1536 multipocillos Plate <ol><li> Utilizando un sistema sellador de microplacas tal como el PlateLoc de microplacas térmica sellador, sellar inmediatamente la placa de múltiples pocillos 1536 usando sello ópticamente claro que es compatible con el instrumento sellador térmico. No toque la superficie de la junta para evitar marcas de borrones. <ol><li> Si se utiliza el PlateLoc térmica Sellador de microplacas, utilice los siguientes ajustes: sellar tiempo 2,0 seg, la temperatura de sellado 162 ° C, presión de aire 82 psi. Este instrumento toma ~ 5 minutos para calentar y así debe ser activado por adelantado. </li><li> Si se utiliza el PlateLoc microplacas térmica sellador, una ADAPTEr debe ser utilizado para elevar la altura de la placa de múltiples pocillos 1536 en el escenario del instrumento para asegurar un buen sellado. NOTA: Si bien es preferible comprar una placa de la etapa para la PlateLoc microplacas térmica sellador, una solución alternativa es insertar cuatro ~ 2 mm de espesor arandelas estándar disponibles en cualquier ferretería en las esquinas para elevar la altura de la placa de múltiples pocillos 1536. </li></ol></li><li> Inmediatamente centrifugar la placa de 1536 pocillos múltiples sellado a 2000 xg durante 3 min a temperatura ambiente para recoger todos los reactivos en la parte inferior de cada pocillo. </li></ol> 5. PCR en tiempo real <ol><li> Programa de un instrumento 1536 qPCR, tales como el LightCycler 1536, con un protocolo de amplificación de dos etapas seguido de un análisis de la curva de fusión. Usando el software LightCycler 1536 estableció un programa de la siguiente manera: <ol><li> Pre-incubación: 95 ° C, 1 min de espera, la tasa de rampa de 4,8 ° C / seg, no adquisición. </li><li> Dos etapa de amplificación: 30 ciclos de [95 ° C, no espera,rampa tasa de 4,8 ° C / seg, ninguna adquisición; 64 ° C, espera 30 seg, velocidad de rampa de 2.5 ° C / seg, sola adquisición]. </li><li> Derretir curva: 95 ° C, 10 seg, la tasa de rampa de 4,8 ° C / seg, no adquisición; 60 ° C, 1 min, la tasa de rampa de 2,5 ° C / seg, no adquisición; 97 ° C, la tasa de rampa de 0,1 ° C / seg, 5 adquisiciones / ° C (continua). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 seg, la tasa de rampa de 2,5 ° C / seg, no adquisición. </li></ol></li><li> Ajuste el formato de detección de &#39;Green intercalando Tinte&#39; en la pestaña Run Definición. </li><li> Ajuste el control de pipeteo de &#39;Master Control&#39; en la pestaña Run Definición. Esta característica sirve como un control interno y detecta la presencia de mezcla maestra qPCR en cada pocillo de la placa de múltiples pocillos 1536, que es útil para identificar falsos negativos putativos. </li><li> Inserte la placa de múltiples pocillos 1536 preparado en los pasos 2-4 en el instrumento 1536 qPCR y ejecutar el programa. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> Perform inspección visual de los datos dentro del software qPCR. NOTA: El software de 1536 permite la visualización tanto de amplificación y derretir curvas, así como un mapa de calor que muestra la llamada (positivo, negativo, no válida, N / A, Figura 2), el valor del punto de cruce (deslizamiento escala de colores para el positivo o gris para el negativo; Figura 3), o un punto final de fluorescencia (EPF) Valor (escala móvil de color). </li><li> Exportar datos del 1536 del software en forma de un archivo .txt (tabla de resultados) o un archivo .xml, ya sea con los datos brutos o datos calculados para el procesamiento en línea del instrumento. NOTA: El punto de cruce automatizado específico (Cp) algoritmo llamando integrado en el software de 1536 tiene en cuenta la forma y la pendiente de la curva de amplificación, mientras que la determinación de las llamadas de valores positivos / negativos y Cp con alta confianza, en volúmenes de reacción microlitro bajo sub con relativamente baja los valores de fluorescencia. </li><li> Si el verde Maestro ADN LightCycler era usod para qPCR, compruebe que todos los pozos pasaron el &quot;control maestro&quot;. Un Despiste indica el bien no recibió mezcla maestra qPCR y el punto de datos faltantes se debe considerar una posible falso negativo. Verifique que todos los pozos pasaron el &quot;control maestro&quot;. Un Despiste indica el bien no recibió mastermix ADN y considerar el punto de datos que falta un potencial de falsos negativos. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, JAM y JDB tienen nada que revelar. RC y AL son empleados de Roche Ciencias de la Vida, de Estados Unidos y trabajó en el desarrollo de la aplicación con LAM como parte de una prueba de principio experimento.

La incorporación de la detección por PCR en tiempo real en el ensayo de genotipado PCRTag es un avance importante para el proyecto Sc2.0 ya que permite un mayor rendimiento significativamente. El flujo de trabajo anterior especifica 2,5 reacciones mu l en placas de 384 pocillos de PCR, 1,5 horas de tiempo térmica de ciclo de ejecución, electroforesis en gel de agarosa, y anotación manual de la gel. El flujo de trabajo que aquí se presenta, llamado análisis qPCRTag, supera varios cuellos de botella importantes. En primer lugar, una carrera qPCRTag condensa 4 x 384 y placas en un único experimento que puede ser procesada, de principio a fin (placa de configurar más el tiempo de ejecución), en aproximadamente una hora. Es importante señalar que el costo de reactivo por pocillo para el análisis qPCRTag está a la par con el enfoque basado en gel de agarosa rendimiento inferior. Sin embargo, eludiendo electroforesis en gel y anotación manual, el flujo de trabajo qPCRTag proporciona ahorros sustanciales en el tiempo y mano de obra, que son las principales ventajas. Es importante destacar que el flujo de trabajo es en qPCRTagenteramente compatible con la automatización. Una preocupación importante con el uso de la detección en tiempo real como la salida del ensayo PCRTag es la tasa de falsos positivos y falsos negativos. Dado que los cebadores PCRTag no fueron diseñados originalmente para su uso en PCR en tiempo real, se espera que no todos los pares de cebadores serán apropiados para su uso con esta salida. Para ello es importante para validar la función y la especificidad de todos los pares de cebadores PCRTag excluir el subconjunto que no funcionan en el ensayo basado en tiempo real en la delantera. Por ejemplo, el cromosoma 3 PCRTag falsos positivos y negativos están haciendo ya gran reproducible en el tiempo real de datos de PCR (Figuras 2 y 3) y estos pueden ser excluidos de los nuevos análisis. Además, los pares de cebadores conocidos a fallar (evaluados por electroforesis en gel y se muestran en las figuras S6 y S7 de Annaluru et al. 1) También se puede excluir. Esto se logra fácilmente, simplemente excluding los pares de cebadores defectuosas al configurar el protocolo de transferencia acústica. Al igual que la mayoría de los ensayos de alto rendimiento, tenemos la intención de utilizar la detección PCRTag tiempo real como pantalla principal para identificar transformantes que merecen una mayor validación aguas abajo. Posteriormente, el estándar de oro para la investigación secundaria permanecerá análisis PCRTag con electroforesis en gel como la lectura. Más allá de la aplicación del análisis PCRTag para Sc2.0, combinando los sistemas de manejo de líquidos a nanoescala con tecnología de última generación con un alto rendimiento en tiempo real la tecnología PCR permite un análisis rápido y automatizado y tiene potencial de impactar muchos campos. Por ejemplo, este flujo de trabajo se podría aplicar a cribado de alto rendimiento de la biblioteca, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, el análisis microbioma, y ​​edición genoma de vanguardia enfoques intentar modificar múltiples loci simultáneamente.

Sc2.0, o el Proyecto Genoma levadura sintética ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), ha fijado el objetivo de diseñar y construir un genoma eucariota totalmente sintético. El uso de la secuencia del genoma altamente comisariada de Saccharomyces cerevisiae 3 como punto de partida, cada uno de los cromosomas lineales dieciséis ha sido rediseñado para satisfacer un conjunto de principios de diseño que especifican mantener la condición física de células, mejorando la estabilidad del genoma, y el aumento de la flexibilidad genética. Por ejemplo, elementos desestabilizadores tales como repeticiones se eliminan de cromosomas Sc2.0. Todas las instancias de los codones de parada TAG son re-codificados para TAA para &#39;liberar&#39; un codón en la cepa final para la introducción de un aminoácido codificado no genéticamente. Además un sistema de evolución inducible, Scramble, habilitado por el sistema Cre-lox, permite la capacidad sin precedentes para generar genomas derivados con nuevas estructuras 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Otro elemento importante del diseño en el genoma Sc2.0 es la introducción de PCRTags, que sirven como marcas de agua de ADN para permitir el seguimiento del ADN de tipo sintético y salvaje. PCRTags son segmentos cortos, re-codificado en ORFs en los cromosomas sintéticos; mientras que las secuencias PCRTag difieren en el nivel de ADN entre los cromosomas tipo sintético y salvajes, las proteínas codificadas son idénticos en secuencia de aminoácidos y, por tanto, presumiblemente, la función. Secuencias PCRTag están diseñados específicamente como sitios de unión del cebador para facilitar la amplificación selectiva (Figura 1A). Diseño PCRTag se lleva a cabo utilizando el algoritmo &#39;más diferente&#39; en GeneDesign 5,6, obteniéndose recodificada secuencias sintéticas que son típicamente ~ 60% diferente de las secuencias nativas (mínimo 33%) con temperaturas de fusión entre 58 ° C y 60 ° C y amplicón longitudes de entre 200-500 pares de bases 2. Recodificación no está permitido dentro de la primera 100 pb de cada ORF, ya que estas regiones son conocidos portienen preferencias especiales en términos de uso de codones 7. En conjunto, estas reglas de diseño a favor de un alto rendimiento de casi todos PCRTags bajo un único conjunto de condiciones de la PCR mediante el cual pares sintéticos y salvajes imprimación tipo PCRTag unen exclusiva y amplifican el ADN sintético y nativo, respectivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag esquemática PCRTags (A) son secuencias dentro de los marcos de lectura abierta (ORF) de los genes en los cromosomas Sc2.0 re-codificadas. (B) sintético (SYN) y de tipo salvaje (WT) primers PCRTag unen exclusivamente y amplifican el ADN genómico de tipo sintético y salvaje (gDNA), respectivamente. Aquí se muestra un análisis de un segmento kb ~ 30 del brazo izquierdo del cromosoma seis, probando trece pares de cebadores PCRTag utilizando ya sea WT o semi-synVIL2 gDNA como plantilla. En muchos casos un solo ORF codifica más de un PCRTag. Presencia / ausencia de amplicones PCRTag se evaluó a través de electroforesis en gel de agarosa. Amplicones PCRTag varían en tamaño desde 200 pb a 500 pb. Las especies que migran más rápidamente en la parte inferior de los paneles son dímeros de cebadores. Análisis PCRTag ha demostrado ser una herramienta importante en el conjunto de cromosomas Sc2.0. En un experimento típico de 30-50 kb de ADN sintético, que codifica 20-30 PCRTags, se transforma en células de levadura para reemplazar el correspondiente ADN de tipo salvaje 1,2,8. Análisis PCRTag se utiliza para identificar los transformantes que codifican PCRTags tipo sintéticos pero no salvaje que abarcan ese segmento de ADN, o los llamados &quot;ganadores&quot;. Por lo general es necesario probar varios transformantes para identificar &quot;ganadores&quot;, por lo que el rendimiento y costo del análisis PCRTag son consideraciones importantes. Actualmente dos cromosomas Sc2.0 se han completado (synIII 1 y synIXR 2), que representa menos del 10% del genoma Sc2.0, although más de la mitad de los cromosomas restantes están actualmente en proceso de síntesis y ensamblaje. La escala de análisis PCRTag requerida para este proyecto está superando rápidamente la capacidad de ejecutar geles y manualmente anotar la presencia de ADN sintético y ausencia de ADN de tipo salvaje. Para mejorar el rendimiento del ensayo PCRTag hemos desarrollado un flujo de trabajo utilizando PCR en tiempo real para eludir el uso de electroforesis en gel de agarosa. El flujo de trabajo hace uso de un dispensador de líquido a granel para distribuir qPCR mezcla maestra en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos 1536, un dispensador de líquido acústica nanoescala para transferir ADN molde y los cebadores, y un termociclador 1536 qPCR, lo que nos permite miniaturizar reacciones a 500 nl y maximizar el rendimiento. Además análisis puede automatizarse. Este tipo de protocolo de genotipado de alto rendimiento debe ser generalizables a cualquier proyecto que requiera análisis de muchos clones en múltiples loci.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

El Proyecto Genoma levadura sintética (Sc2.0) tiene como objetivo construir 16 cromosomas de la levadura de diseño y combinarlos en una sola célula de levadura. Hasta la fecha, un cromosoma sintético, synIII 1, y un brazo cromosoma sintético, synIXR 2, se han construido y su función in vivo validado en ausencia de los correspondientes cromosomas de tipo salvaje. Una característica importante del diseño de los cromosomas Sc2.0 es la introducción de PCRTags, que son secuencias cortas, re-codificado dentro de los marcos de lectura abierta (ORFs) que permiten la diferenciación de los cromosomas sintéticos a partir de sus homólogos de tipo salvaje. PCRTag cebadores hibridan selectivamente a cualquiera de cromosomas sintéticos de tipo o salvajes y la presencia / ausencia de cada tipo de ADN se puede probar con un simple ensayo de PCR. La lectura estándar del ensayo PCRTag es evaluar la presencia / ausencia de amplicones por electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, con una densidad media amplicón PCRTag de uno por 1,5 kb y agenome tamaño de ~ 12 Mb, el genoma Sc2.0 completado codificará aproximadamente 8.000 PCRTags. Para mejorar el rendimiento, hemos desarrollado un ensayo de detección basado en la PCR en tiempo real para PCRTag genotipado que llamamos análisis qPCRTag. El flujo de trabajo especifica 500 reacciones nl en una placa de múltiples pocillos 1536, lo que nos permite probar hasta 768 PCRTags con ambos pares de cebadores de tipo sintético y salvajes en un solo experimento.

Probamos sintético y de tipo salvaje cromosoma 3 pares de cebadores PCRTag 1 con la levadura de ADN genómico (ADNg) extraído de cuatro cepas diferentes. Cromosoma 3 tiene 186 pares PCRTag de cebadores que abarcan la longitud del cromosoma (synIII es ~ 270 kb y de tipo salvaje del cromosoma 3 es ~ 315 kb). Para probar cada una de las cuatro cepas con ambos conjuntos de cebadores, dividimos la placa de múltiples pocillos en cuatro cuadrantes, uno para cada tipo de gDNA, asignando cebadores PCRTag sintéticos para la mitad superior de cada cuadrante y de tipo salvaje de la mitad inferior. El ADN genómico se extrajo de las cepas de levadura, dos de los cuales codifican tipo salvaje cromosoma 3 (tipo salvaje, synIXR 2), mientras que los dos codificar cromosoma sintético 3 restante (synIII 1, synIII synIXR). mezcla maestra qPCR se dispensó en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos 1536 usando un dispensador de líquidos a granel, seguido de gDNA y PCRTag cebadores utilizando los Echo 550. Los cebadores fueron dispuestos de manera idéntica encada cuadrante de la placa de múltiples pocillos para la comparación visual fácil. La placa de múltiples pocillos fue luego térmicamente sellada con sello ópticamente claro y se sometió a análisis de PCR en tiempo real. En este experimento se observó qPCRTag, en su mayor parte, la amplificación como se esperaba, por lo que amplifican exclusivamente cebadores sintéticos de ADN sintético y viceversa (Figuras 2 y 3). Sin embargo, también se observó varias desviaciones del patrón esperado, lo que sugiere falsos negativos y falsos positivos en el conjunto de datos. En este experimento, se detectó el control maestro en 100% de los pozos, lo que indica el dispensador de líquido a granel dispensado con éxito Mastermix en cada pocillo de la placa (datos no mostrados). Esto descarta una fuente potencial de falsos negativos. Además, algunos de los cromosomas 3 PCRTags se conocen a fallar (mostrado en las Figuras S6 y S7 de Annaluru et al. 1), incluyendo al menos 2 SYN y 1 WTprimer pares; por lo tanto estos pozos pueden ser ignorados en cada cuadrante. Los verdaderos falsos negativos podrían surgir de la falta de transferencia de gDNA plantilla o cebadores, sin embargo, en nuestra experiencia, dada la correcta calibración del Echo 550, así como la preparación de gDNA y cebadores como se describe, esto no ha sido una importante fuente de error. En general, en este experimento, la tasa de falsos negativos fue extremadamente baja para cebadores WT con plantilla WT (~ 2%), aunque algo mayor para cebadores con SYN SYN ADN (~ 8%). Los falsos positivos, la detección de la señal en los pocillos en los cebadores SYN se mezclan con WT gDNA (y viceversa), pueden surgir de la amplificación cruz o dímeros de cebadores. De hecho, los dímeros de cebadores son a menudo visible por electroforesis en gel (Figura 1B) y representan una fuente de error razonable. Para la aplicación de qPCR, el examen de las curvas de fusión puede ser útil para determinar si diferentes especies, tales como dímeros de cebadores, pueden estar contribuyendo a una señal. Además, performing un experimento de control mediante el cual cebadores se dispensan en ausencia de plantilla de ADN puede ayudar a identificar cebadores con una propensión a dimerizar. Cross amplificación pueden ser observados por electroforesis en gel, en particular si demasiados ciclos de PCR se llevan a cabo o si la temperatura de recocido es demasiado bajo. Hemos tratado de minimizar el número de falsos positivos debido a la amplificación cruzada mediante la optimización de estos dos parámetros para el protocolo qPCRTag. Por último, el examen de los valores de punto de cruce (Cp) para cada pozo puede ayudar a identificar cebadores que no son adecuados para la detección basada en tiempo real (Figura 3, por ejemplo, BB22, FB22, BB46, Fb46). En general, en este experimento, la tasa de falsos positivos fue baja para cebadores SYN con plantilla WT (~ 5%) y más alto para los cebadores WT con plantilla SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Placa mapa de calor que muestra la presencia / abllamada sence para un experimento qPCRTag. Cuatro tipos diferentes de ADN genómico (cuadrantes separados por líneas blancas sólidas) se sometieron a análisis PCRTag usando sintético (SYN) y de tipo salvaje (WT) cromosoma 3 cebadores PCRTag (líneas blancas discontinuas para separar SYN (arriba ) y WT (abajo) en cada cuadrante). WT y synIXR gDNA codifican tipo salvaje cromosoma 3, produciendo la amplificación con cebadores WT PCRTag. SynIII y synIII synIXR gDNA codificar cromosoma sintético 3, produciendo la amplificación con cebadores SYN PCRTag. Los cebadores están dispuestos de acuerdo con su posicionamiento cromosómica de izquierda a derecha y colocados de forma idéntica en los cuatro cuadrantes para la comparación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: calor de placasmapa que muestra punto de cruce (Cp) valor para un experimento de qPCRTag. Este es el mismo conjunto de datos como en la Figura 2 y la disposición de la placa es por lo tanto idéntica. N / A se refiere a &#39;sin amplificación &quot;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vistas.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Investigación

Biología

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...