<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La estructura tridimensional de la cistatina del complejo B (azul) con papaína (amarillo). Mutado residuos de la cistatina B se muestran en rojo. 1. Principios de la Marca de análisis sin la interacción con los sistemas de Biacore En un experimento de unión típica etiqueta sin utilizar un sistema de Biacore, una biomolécula llamado el &quot;ligando&quot; se une a la superficie de un chip sensor. Un sistema de flujo de canales trae su pareja de unión, denominada &quot;analito&quot;, en contacto con la superficie del chip, donde la detección se lleva a cabo. Cuando el analito se une al ligando, el cambio resultante en la acumulación de masa en la superficie se detecta por la resonancia de plasmones superficiales (SPR). La respuesta de SPR es proporcional a la cantidad de analito vinculante. Dado que la unión se mide en tiempo real, la cinética de asociación y de las constantes de disociación de velocidad para una interacción específica puede ser determinada. A partir de estas constantes, es posible calcular la afinidad como la constante de disociación de equilibrio. También es posible calcular la afinidad de los datos del estado de unión estable. Una metodología similar se puede también utilizar para determinar la concentración de una proteína que se une específicamente a un ligando en la superficie. 2. Analizar las propiedades cinéticas de la interacción proteína-proteína En X100 Biacore, análisis cinético se puede realizar utilizando un solo ciclo de la cinética. En un experimento de un solo ciclo de la cinética, una serie de concentraciones del analito se inyecta en un ciclo único análisis sin regeneración de la superficie en medio de inyecciones. Por lo tanto, de un solo ciclo de la cinética permite el análisis de cinética cuando es difícil encontrar las condiciones adecuadas de regeneración. Una vez que los datos de un experimento cinético se ha recogido, X100 Biacore software de evaluación genera los valores de k a, d k, y D K ajustando los datos a un modelo de interacción. 3. Enfoques para determinar la concentración de proteína Analizar las interacciones entre biomoléculas es importante para entender su función. La caracterización de la unión de las proteínas con otras proteínas, de ácido nucleico, o las pequeñas moléculas es fundamental para la investigación bioquímica, y se emplea en muchas otras áreas, incluyendo el descubrimiento de fármacos. Para una medición exacta de la cinética de la interacción entre dos proteínas que interactúan, es esencial conocer la concentración de la proteína se une específicamente en la muestra experimental que se utiliza como sustancia analizada. Una lectura de un espectrofotómetro de 280 o ensayos colorimétricos, tales como el empleo de un reactivo de Bradford se utiliza comúnmente para determinar la concentración de proteína total. Sin embargo, las impurezas de proteínas puede afectar el resultado. Más importante aún, las dos formas activa e inactiva de la proteína se incluyen en la concentración de proteína total. Particularmente en el caso de las proteínas recombinantes, que puede estar inactiva debido al doblez incorrecta, es importante para determinar el porcentaje de proteína que se une específicamente en la muestra. En X100 Biacore, la concentración en relación con la actividad de unión específica puede ser determinada por la comparación de los niveles de respuesta obligatoria a una curva de calibración derivada de un estándar conocido, o mediante el uso de la Libre de Calibración metodología más recientemente introducido el análisis de concentración (ACCP). ACCP no se basa en un estándar. Por lo tanto, CFCA es particularmente útil en el caso del estudio de las formas mutantes de las proteínas, donde las normas no suelen estar disponibles. En un experimento de la ACCP, el tipo de unión inicial se mide a diferentes caudales en condiciones cuando la difusión de la muestra a la superficie del chip es la velocidad. El coeficiente de difusión de la sustancia analizada, las dimensiones de la celda de flujo y las velocidades de flujo se tienen en cuenta en el cálculo de la concentración de la unión específica de la tasa de 1,2 consolidación inicial. En un experimento de cinética, la concentración de la sustancia analizada se utiliza en el cálculo de la cinética de velocidad de asociación constante y la afinidad de los datos experimentales. ACCP y la medición cinética en los sistemas de Biacore ambos se basan en las propiedades de la interacción misma. Por lo tanto, con la concentración de unión específica determinada por el análisis de Biacore, en lugar de la concentración de proteína total, aumenta la fiabilidad de los resultados. 4. Utilizando el análisis de Biacore para caracterizar la interacción entre la cistatina B y la papaína B cistatina mamíferos es un inhibidor reversible, competitiva a proteínas y fuerte unión de cisteína proteinasas papaína-como, sobre todo la catepsina B, H, K, L y S. Estas proteínas están implicadas principalmente en nonsla degradación intracelular de proteínas electiva. Cistatinas se supone que protegen a las células y los tejidos de la proteólisis inadecuado por estas enzimas. También inactivar proteasas cisteína a partir de parásitos y virus y puede participar en la defensa contra la invasión de estos agentes infecciosos. Además, cistatinas inhibir varias cisteína proteinasas de plantas, tales como la papaína, que se utiliza con frecuencia como una enzima modelo en los estudios de estructura-función. La estructura tridimensional del complejo B cistatina con papaína 3 muestra que la interacción entre las dos proteínas está dominado por los contactos hidrofóbicos, lo que, desde el lado de inhibidor, se proporcionan por la N-y C-terminal y dos lazos de la horquilla ( Figura 1). En este estudio, se analiza la importancia del extremo C-terminal y el segundo bucle de unión de la cistatina B para unirse a la papaína mediante el uso de la cistatina B bovina variantes que contienen mutaciones puntuales en las áreas de interacción con papaína. En primer lugar, determinar la concentración de unión específica de las cuatro variantes de la cistatina B utilizados, así como la de la proteína de tipo salvaje. Una vez que las concentraciones de unión específica de la cistatina B activa se determinan las constantes de velocidad y la afinidad de tipo salvaje y las variantes mutantes de la cistatina B vinculante a la papaína se miden utilizando X100 Biacore. 5. Instrumentos y reactivos <ol><li> Las variantes B cistatina Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala y Cys3Ser se producen a lo descrito previamente 4. Todos los mutantes contienen una sustitución adicional de cisteína a serina en la posición 3, para evitar la formación de dímeros vinculados disulfuro inactivos de la cistatina B. </li><li> El objetivo de la papaína también se prepara como se describió anteriormente 5. Es S-(metiltio) papaína (MMTS-la papaína) que tiene un grupo metiltio unido a Cys25 en el activo fisura, lo que hace la proteasa catalíticamente inactiva. </li><li> X100 X100 Biacore con Biacore Package Plus se utiliza para medir y analizar las concentraciones de uniones específicas y cinética de unión. </li><li> MMTS-la papaína se inmoviliza en CM5 chip sensor con Biacore Kit de acoplamiento Amine. </li><li> Las carreras se llevan a cabo a 25 ° C, y el buffer es de 0,01 M Hepes a pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 0,0034 M, y 0,05% de polisorbato 20. </li><li> Entre cada variante de la cistatina B, la superficie del sensor se regenera con NaOH 20 mM durante 30 segundos a un caudal de 10 l / min. </li></ol> 6.Immobilization del ligando MMTS-la papaína La unión covalente de MMTS-la papaína para el análisis de la ACCP CFCA se basa en la medición de la tasa de unión en las condiciones en que se limita la velocidad de difusión de moléculas de analito en la superficie (limitación de transporte masivo). Esto se ve favorecido por los niveles altos de inmovilización del ligando. Inmovilización de la papaína se MMTS-configurar y ejecutar utilizando el asistente de la inmovilización de software de control de Biacore X100. <ol><li> Activar la superficie de la celda de flujo 2 de la inyección de una mezcla de succinimida (NHS) y carbodiimida (EDC) por 7 minutos, con un caudal de 10 l / min. Una celda de flujo se deja sin cambios para ser utilizados como superficie de referencia. </li><li> Inyectar MMTS-la papaína en 50μg/ml en tampón de acetato sódico a pH 4,5 durante 15 minutos a un caudal de 5 l / min. </li><li> Etanolamina se inyecta durante 7 minutos con un caudal de 10 l / min para desactivar el resto de ésteres activos. </li></ol> El procedimiento de acoplamiento todo debe resultar en ~ 3000 RU-MMTS papaína inmovilizada en la celda de flujo 2. La unión covalente de MMTS-la papaína para el análisis cinético El mismo procedimiento se utiliza para inmovilizar MMTS-la papaína para el análisis cinético, con la única diferencia es que en el análisis cinético, el nivel de inmovilización debe ser baja para evitar que la tasa de unión cada vez limitada por la difusión. Una celda de flujo se deja sin modificar en este paso y con el fin de ser utilizado como superficie de referencia. <ol start="4"><li> Después de la activación de la superficie con la mezcla de NHS y EDC como en 7.1, MMTS-la papaína se inyecta en 1μg/ml durante 50 segundos. Después de que la superficie se desactiva con una inyección de etanolamina como en el paso 7.3. </li></ol> El nivel de acoplamiento debe ser de aproximadamente 50 RU después de este procedimiento. 7. La cistatina determinar la concentración de B utilizando el ensayo de CFCA <ol><li> El experimento de la ACCP está configurado de acuerdo con el asistente de la ACCP en X100 Biacore Package Plus. Aproximadamente el 10 nM proteína que se inyecta en los caudales de 10 y 100 l / min por duplicado en 48 segundos. La superficie se regenera con 20 mM NaOH entre cada ciclo. </li><li> Incluyen las inyecciones en blanco para cada caudal. </li><li> La concentración de proteína se determina a partir del enlace de datos (Figura 3) utilizando ªe CFCA función de la evaluación de X100 Biacore Además el software de evaluación de paquetes. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los resultados del análisis de la ACCP B. cistatina de tipo salvaje Los datos específicos de unión de concentración fue extraído de la sensorgrams obtenidos en los caudales de 10 y 100 l / min. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Concentraciones de la figura 3. De los mutantes determinado utilizando una medida 280 (n = 3) y la ACCP (n = 2). Los errores estándar se indican mediante barras de error. Los coeficientes de absorción molar se calcula como se describe en (6). Una gran diferencia en los valores de concentración de Cys3Ser/Leu73Gly mutante determinado por los dos métodos se pueden observar. </li><li> Al comparar la concentración determinada por una medición de 280 con que por CFCA, es claro que, mientras que en la mayoría de los casos la proteína se encuentra en plena actividad, para la variante Cys3Ser/Leu73Gly, la fracción de la proteína activa es muy baja (Figura 3). La siguiente tabla muestra las actividades de las variantes B cistatina relacionados con la concentración total de un 280. <table border="0"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> CFCA en relación con un 280 (%) </td></tr><tr><td> De tipo salvaje </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. La medición de la cinética de la cistatina B unión a la papaína <ol><li> Basándose en las mediciones CFCA, preparar una serie de concentraciones de dos veces que van desde 2,5 a 40 nm para cada una de las variantes de la cistatina B. </li><li> El experimento de cinética se ha configurado mediante el asistente de la cinética en X100 Biacore con el enfoque de ciclo único. La superficie no se regenera entre las inyecciones, pero después del final de cada ciclo de análisis utilizando 20 mM NaOH como solución de la regeneración. </li><li> Configurar el experimento de manera que cada ciclo con la muestra está flanqueada por un ciclo en blanco, donde se inyecta buffer en lugar de muestra. </li><li> Utilice la función de evaluación de la cinética en X100 Biacore para realizar automáticamente las sustracciones en blanco de referencia resta de datos antes de instalar un modelo de interacción de 1:1. </li><li> Los datos experimentales obtenidos para la unión de las variantes B cistatina a la papaína se muestra en la Figura 4. La siguiente tabla resume la asociación y las constantes de disociación y la tasa de las constantes de disociación de equilibrio obtenidos en el análisis cinético. <table border="0"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> k a (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> De tipo salvaje </td><td> 1,8 x 10 6 </td><td> 0.41 x 10 -3 </td><td> 2.3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 1.7 x 10 -3 </td><td> 1,5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2,2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1.7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0,9 x 10 6 </td><td> 0.53 x 10 -3 </td><td> 5.8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Perfiles cinéticos para las variantes B cistatina unión a MMTS-la papaína determina usando la cinética de un solo ciclo. Sensorgrams muestran en blanco y resta de datos de referencia con el ajuste cinético de un modelo de interacción 1:01 superpuestas en negro. </li><li> Mientras que las tasas de asociación de los mutantes son comparables a la de la proteína de tipo salvaje (Figura 5, panel superior), las constantes de velocidad de disociación de los mutantes pueden ser más altos en cerca de dos órdenes de magnitud, con un aumento correspondiente en el equilibrio de disociación constante (Figura 5, panel inferior). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Los cálculos de las constantes de velocidad y la afinidad se basaron en las concentraciones obtenidas a partir de la ACCP. Los cambios de k a, d k y K D, asociada con las mutaciones se representan en los gráficos. </li><li> Dado que la concentración de la muestra es un parámetro en el cálculo de la tasa constante de asociación de los datos experimentales, esimportante que es correcto. Utilizando la concentración basada en la medición de un 280 en lugar de la ACCP llevaría a la conclusión de que Leu73 es importante para la velocidad de asociación, que la sustitución parece ser el resultado de cerca de 10 veces más lenta que la asociación de las variantes B cistatina otros. Sin embargo, la concentración de unión específica medida por la ACCP es sólo el 10% del total de proteínas en este caso. Cuando esto se toma en cuenta este aspecto se pone de manifiesto que la tasa de asociación para Leu73 es similar a la de las otras variantes. Por lo tanto, CFCA permite la evaluación correcta de un k K y D lo que hace posible la interpretación adecuada del mecanismo de interacción. </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

El autor es empleado de GE Healthcare, que produce los reactivos y los instrumentos utilizados en este artículo.

En este trabajo, cuatro mutantes y B de tipo salvaje cistatina fueron producidos con el fin de evaluar la importancia del lazo de unión segundo y C-terminal para la interacción entre la cistatina B y papaína. Este estudio demostró la ventaja y facilidad de uso de X100 Biacore para determinar la concentración y la unión específica para analizar la cinética de las interacciones proteína-proteína para entender la relación estructura-función. Hemos demostrado que la medición de la concentración de proteínas totales no revela las variantes de proteínas que han reducido la actividad de unión, que en este caso presenta un error de medición importante en la determinación de la afinidad de unión y la cinética. Las concentraciones de unión específica de las variantes de la cistatina B se determinaron utilizando CFCA con X100 Biacore. Usando las mediciones de concentración de CFCA como insumo para el análisis cinético resultó en una tasa fiable y constantes de afinidad, lo que permite la correcta interpretación del mecanismo de interacción. Disminución de las afinidades de los mutantes se debe casi exclusivamente a un aumento de k d-valor, mientras que k se vio afectado un poco. Este comportamiento indica que tanto la segunda región lazo de unión y el extremo C-terminal no son importantes para el tipo de unión del inhibidor a la papaína. Por el contrario, contribuir a la afinidad de unión principalmente por mantener el inhibidor unido a la enzima una vez que el complejo se ha formado.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

En este estudio, se explora la interacción entre el B cisteína proteasa bovina cistatina inhibidor y una forma catalíticamente inactiva de la papaína (Fig. 1), una proteasa cisteína planta, por análisis en tiempo real sin etiquetas usando X100 Biacore. Varias variantes B cistatina con mutaciones puntuales en las áreas de interacción con la papaína, que se producen. Para cada variante B cistatina que determinar su concentración de unión específica con la calibración sin el análisis de concentración (ACCP) y comparar los valores obtenidos con la concentración de proteínas totales, determinada por un<sub&gt; 280</sub&gt;. Después de eso, la cinética de cada variante B cistatina vinculante a la papaína se mide con un solo ciclo de la cinética (SCK). Se demuestra que una de las cuatro variantes de la cistatina B examinamos es sólo en parte activa de la unión. Esta actividad parcial, revelada por la ACCP, se traduce en una diferencia significativa en la tasa constante de asociación (<em&gt; K</em<sub&gt; A</sub&gt;) Y afinidad (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), En comparación con los valores calculados utilizando la concentración de proteína total. Utilizando CFCA en combinación con el análisis cinético en un estudio de estructura-función contribuye a la obtención de resultados fiables, y ayuda a hacer la correcta interpretación del mecanismo de interacción.

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Nosotros aplicamos la etiqueta sin análisis de la interacción de proteínas utilizando Biacore X100 para el análisis de estructura-función de la unión de varios mutantes cistatina B a la papaína través de la caracterización cinética. Libre de calibración de análisis de concentración (ACCP) mide la concentración de proteína con actividad de unión retenido sin la necesidad de una curva patrón. Nos muestran que la confirmación de las concentraciones de uso de la ACCP aumenta la fiabilidad de los análisis cinético y que las constantes cinéticas se puede determinar de forma fiable, incluso si la actividad de una proteína recombinante se reduce.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K vistas.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. Nosotros aplicamos la etiqueta sin análisis de la interacción de proteínas utilizando Biacore X100 para el análisis de estructura-función de la unión de varios mutantes cistatina B a la papaína través de la caracterización cinética. Libre de calibración de análisis de concentración (ACCP) mide la concentración de proteína con actividad de unión retenido sin la necesidad de una curva patrón. Nos muestran que la confirmación de las concentraciones de uso d...

Video: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Investigación

Biología

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Spot de Tejidos correcta cada vez que en los bloques de múltiples tejidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...