Los anticuerpos se utilizan habitualmente en técnicas de laboratorio y sus aplicaciones terapéuticas y diagnósticas se están expandiendo rápidamente. La caracterización rápida y precisa de la unión antígeno-anticuerpo es de vital importancia para estas aplicaciones. La fotometría de masas mide rápidamente las afinidades de unión utilizando cantidades extremadamente pequeñas de material.
No se requiere etiquetado o inmovilización y se puede obtener información sobre la oligomerización y pureza de las proteínas del mismo experimento. Este protocolo se puede utilizar no sólo para estudiar anticuerpos, sino también para medir fuertes unión proteína-proteína para proteínas con una masa molecular superior a 50 kilodaltons. Comience usando fórceps de punta suave y lave las botellas para enjuagar secuencialmente los cubreobjetos de 24 por 50 milímetros de arriba a abajo con agua destilada, etanol, agua destilada, isopropanol y agua destilada.
Después del último lavado, seque los cubreobjetos con una corriente de nitrógeno limpio en la misma dirección para evitar transferir la contaminación de los fórceps. Enjuague los cubreobjetos de 24 por 24 milímetros con agua destilada y etanol como se demuestra, seguido de secado con una corriente de nitrógeno limpio. Después del secado, coloque un cubreobjetos de 24 por 24 milímetros en un pedazo de papel de aluminio y coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara en el cubreobjetos.
A continuación, corte el cubreobjetos de 24 por 24 milímetros de la lámina y presione suavemente la lámina en el lado de trabajo del cubreobjetos de 24 por 50 milímetros. Para preparar muestras de anticuerpos y antígenos para las mediciones de afinidad, filtre al menos dos mililitros de PBS a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar partículas de polvo y agregados, y centrifugar las reservas de anticuerpos y antígenos de interés. Mida la absorbancia UV de 280 nanómetros de las poblaciones de anticuerpos y antígenos para determinar sus concentraciones reales y prepare una serie de valoración de mezclas de anticuerpos y antígenos en el rango adecuado de concentraciones de antígenos en un volumen final de 50 microlitros por muestra.
A continuación, incubar las mezclas de antígeno-anticuerpo durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que la reacción de unión alcance el equilibrio químico. Para evaluar la afinidad anticuerpo-antígeno por fotometría de masas, aplique una gota de aceite de inmersión del microscopio al objetivo del instrumento y coloque la cámara de flujo en la etapa del microscopio. Agregue 10 microlitros de PBS filtrados a un extremo del canal de la cámara de flujo.
El búfer entrará en el canal por acción capilar. En la pestaña de control de enfoque del software de recopilación de datos, utilice los botones de movimiento de etapa grueso hacia arriba y hacia abajo para realizar los ajustes iniciales y haga clic en nitidez para ver la lectura de la señal de nitidez. Utilice los botones de ajuste finos hacia arriba y hacia abajo para maximizar el valor de nitidez y haga clic en establecer el enfoque y el enfoque de bloqueo para activar la función de seguimiento de enfoque.
Una imagen de una diapositiva limpia debe tener un valor de señal igual o inferior al 0,05% Cargar 20 microlitros de la primera muestra de anticuerpos y antígenos como se ha demostrado, hinchando el líquido del otro extremo con un pequeño trozo de papel hinchado. Inmediatamente después de la carga, haga clic en registro para adquirir el número adecuado de fotogramas equivalente a 100 segundos de datos. Al final del período de recopilación de datos, escriba un nombre de archivo para los datos y haga clic en Aceptar y, a continuación, muestree para guardar el archivo.
Para analizar los datos de fotometría de masas, abra el archivo de interés y haga clic en Analizar. Haga clic en cargar para cargar la función de calibración y haga clic en el archivo y guarde los resultados para guardar los datos analizados. Para obtener las concentraciones relativas de cada especie en la muestra, abra los eventosfitted.
csv, copie los datos de la columna M en el software de trazado y análisis adecuado y utilice la función histograma de estadísticas de trazado para trazar la distribución de masa molecular. Haga doble clic en el histograma para abrir la ventana de propiedades de trazado, deshabilitar el binning automático y seleccionar un tamaño de bin de 2,5 kilodaltons. Para crear los centros de ubicación y los datos de recuentos, haga clic en Aplicar y listo.
Para ajustar el histograma con funciones gaussianas, seleccione las columnas de centros de ubicación y recuentos y haga clic en los picos de análisis y la función de menú de ajuste de pico múltiple de línea base. Haga doble clic para indicar las posiciones de pico aproximadas en la gráfica de distribución y haga clic en Abrir ajuste NL. Marque las casillas de verificación fijas para los centros de pico XC y establezca sus valores en las masas moleculares esperadas del anticuerpo libre y los complejos de anticuerpos antigenos simples y dobles.
Marque la opción de compartir para los parámetros de anchura y haga clic en ajustar. Los valores de altura máxima ajustados de los componentes gaussianos representan la concentración relativa de cada especie en la muestra. A continuación, utilice la ecuación para calcular la fracción de concentración de cada especie a partir de los valores de altura máxima.
Para calcular constantes de equilibrio mediante un programa de hoja de cálculo, abra la restricción de disociación. hoja de trabajo xlsx. En esta hoja de trabajo, los valores de celda resaltados en amarillo en las filas 1 a 10 se pueden modificar para realizar los cálculos constantes de equilibrio.
Introduzca los valores constantes estimados de disociación en unidades nanomolares en las células B1 y B2. Si no se conocen los valores constantes de disociación estimados, deje los valores predeterminados en las celdas B1 y B2 sin cambios. Ingrese las concentraciones totales de anticuerpos y antígenos totales en unidades nanomolares en las células D2 y E2 e ingrese los valores de fracción calculados para cada especie en las células F2, G2 y H2. Al realizar un análisis global de la valoración, agregue los valores de fracción de datos adecuados en las filas 2 a 10. En la ventana de parámetros del solucionador, seleccione la celda B15 para el cuadro objetivo establecido y las celdas B1 a B2 para el cuadro de celdas variables cambiando.
Seleccione el botón min para la opción to y marque la casilla de verificación make unconstrained variables non-negative, luego seleccione GRG nonlineal como método de resolución y haga clic en solve. Los valores constantes de disociación de mejor ajuste se mostrarán en las celdas B1 y B2. Y la suma final de los errores al cuadrado se mostrará en la celda B15. En este experimento representativo, se realizó una serie de valoración con el anticuerpo antihumano trombina a una concentración fija de 25 nanomolares y 0, 7,5, 15, 30, 60 y 120 concentraciones nanomolares de alfa-trombbina humana para obtener las distribuciones de masa molecular de las mezclas de antígenos-anticuerpos y la muestra de anticuerpos únicamente.
Los parámetros de altura máxima de mejor ajuste de los componentes gaussianos se normalizaron para obtener fracciones de concentración de especies. Los valores de la fracción de concentración se ajustaron globalmente para obtener las afinidades de unión antígeno-anticuerpo. Las fracciones de concentración experimental y los resultados de ajuste global para el anticuerpo libre, el complejo de anticuerpos antigenos individuales y el complejo de doble antígeno podrían entonces ser trazados.
Para obtener valores de KD precisos, las concentraciones de proteínas deben seleccionarse cuidadosamente para poblar todas las especies de reacción. Recomendamos preparar una serie de valoración utilizando una serie de concentraciones de antígenos. Después de ajustar los datos, el método de proyección de error se puede utilizar para obtener el error de ajuste, pero es mejor repetir el experimento y calcular las desviaciones estándar de los valores de afinidad de enlace promedio.
