Encienda el microscopio confocal de escaneo láser y coloque el portaobjetos en el portaobjetos. Para la visualización y adquisición de imágenes, seleccione la lente objetivo 20X. Desde el software confocal, seleccione el modo de escaneo secuencial para evitar la diafonía entre BODIPY 493/503 y DAPI.
Luego excite el troquel BODIPY 493/503 usando la línea láser de argón de 488 nanómetros y la tinción DAPI usando la línea láser de 405 nanómetros. Establezca los rangos de emisión en 493 a 589 nanómetros para BODIPY y 410 a 464 nanómetros para DAPI. A continuación, configure los ajustes del microscopio ajustando los tamaños de fotograma, la velocidad de escaneo y el promedio, que incluye el número dos veces la profundidad de bits como 12 bits, la dirección como bidireccional, el zoom digital del área de escaneo menos uno y el agujero de alfiler menos una unidad de área.
Ajuste la configuración de ganancia y ganancia digital. Asegúrese de que no haya píxeles saturados como indica el indicador de rango. Después de identificar con precisión las gotas de lípidos, adquiera la imagen con los canales BODIPY y DAPI.
Para crear imágenes de área amplia, cambie a una lente subjetiva 10X. Luego active el modo de escaneo de mosaico y configúrelo para generar imágenes de mosaico de cinco por cinco. Para generar vistas 3D y ortogonales, aplique una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y cambie la lente del objetivo a una lente 40X.
Seleccione el modo Z-stack. Ajuste el plano Z para definir la primera y la última posición para la captura de imágenes, asegurando un grosor de corte óptico de aproximadamente 0,5 micras para capturar todas las gotas enfocadas. Seleccione el módulo ortopédico y cree vistas ortogonales.
Adquiera imágenes 3D seleccionando el módulo 3D siguiendo el modo de representación de transparencia. Después de la adquisición de imágenes, comience a procesar y analizar imágenes de un solo plano con CellProfiler. Cargue las imágenes en formato TIF haciendo clic en el modo de imágenes en la esquina superior izquierda de la interfaz de CellProfiler.
Utilice el módulo de nombres y tipos para ordenar entre las imágenes teñidas de gotas BODIPY y núcleos DAPI en función de los nombres de archivo. Para el análisis de gotas de lípidos, use solo imágenes teñidas con BODIPY. Inicie la construcción de tuberías haciendo clic en ajustar módulos y seleccione el módulo de color a gris para convertir las imágenes en escala de grises.
Luego, utilizando el módulo de identificación de objetos primarios, defina las gotas de lípidos entre 6 y 300 píxeles y un factor de corrección de umbral de uno para detectar gotas de lípidos dentro de las imágenes en escala de grises. Para medir la intensidad de píxeles de las gotas de lípidos identificadas, agregue un módulo de intensidad de objeto de medida. Incorpore un módulo adicional de objetos de filtro para garantizar que solo se cuantifiquen las señales más fuertes, mientras que las señales menos intensas se excluyen del análisis final de gotas de lípidos.
A continuación, para medir las gotas de lípidos relacionadas con los datos de salida, agregue el módulo de forma de tamaño de objeto de medida. Luego agregue un módulo de contornos de superposición para superponer la gota identificada en la imagen original y así asegurarse de que la segmentación también se vea precisa en la imagen sin procesar. Una vez hecho esto, agregue un módulo de exportación a hoja de cálculo y haga clic en el botón analizar imágenes en la esquina inferior izquierda.
En comparación con el control, los animales alimentados con HFD presentaron un perfil dislipidémico pronunciado y un aumento sutil en los niveles de triglicéridos circulantes. Las imágenes de área amplia revelaron un aumento de las gotas de lípidos en los hígados de los animales alimentados con HFD. El análisis con CellProfiler reveló un mayor número de gotas de lípidos hepáticos, una mayor intensidad de fluorescencia BODIPY, una relación de área del 360% y diámetros más grandes.
La distribución del tamaño en animales alimentados con HFD reveló un aumento en las gotas de lípidos hepáticas macrovesiculares de más de nueve micras y una reducción en las microvesículas de menos de tres micras.
