Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

Comience colocando el tejido en una placa de cultivo de tejido estéril y retirando el exceso de medio. Mide el tejido con una regla de metal estéril y fotografía. Agregue tres mililitros de medios DMEM/F-12 avanzados al tejido cortado y pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo para lavarlo.

A continuación, lave el pañuelo con tres mililitros de PBS. Aspire el medio de la placa de cultivo de tejidos y córtelo en trozos pequeños con cuchillas estériles y dos mililitros de medios de digestión. A continuación, recoja el tejido en un tubo de 50 mililitros que contenga cinco mililitros en total del medio de digestión.

Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante una hora. Mezcle periódicamente la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Inactive la tripsina añadiendo cinco mililitros de DMEM/F-12 avanzado al tubo.

A continuación, filtre la muestra a través de un colador de poros de 70 micrómetros para eliminar cualquier residuo grande. Ahora pipetee dos mililitros de DMEM que contienen un 10% de FBS en la parte superior del filtro y use una pipeta para recolectar los desechos y restos de tejido para el cultivo de fibroblastos. A continuación, coloque los restos en una placa para el cultivo de fibroblastos.

Centrifugar el filtrado a temperatura ambiente de 200 a 300 G durante cinco minutos y luego aspirar el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de DMF 12 avanzado al pellet y centrifugue la suspensión nuevamente a 300 G durante cinco minutos. Para la lisis de glóbulos rojos, vuelva a suspender el gránulo en cuatro mililitros de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros.

Incuba las células a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de centrifugar la mezcla en las mismas condiciones que se demostraron anteriormente, aspirar el sobrenadante. Al gránulo, agregue cinco mililitros de DMEM/F-12 avanzado y vuelva a centrifugar a cuatro grados centígrados.

Después de aspirar el sobrenadante, agregue un mililitro de reactivo de disociación celular disponible comercialmente al gránulo e incube durante dos o tres minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, centrifugar y aspirar el sobrenadante una vez más. A continuación, vuelva a suspender el perdigón en cinco mililitros de DMEM/F-12 avanzado.

Disocie los grumos celulares pipeteando la suspensión varias veces con una pipeta P1000. Centrifugar la suspensión y retirar el sobrenadante. A continuación, obtenga puntas de pipeta P1000 y P200 preenfriadas, y utilice las puntas frías fijadas en la pipeta P1000 para resuspender el gránulo celular en la matriz de membrana, antes de colocar el Falcon en hielo para evitar la solidificación.

Obtenga la placa precalentada de la incubadora. Utilizando la pipeta P200 ajustada a 48 microlitros y utilizando puntas frías, cree cúpulas de matriz de membrana basal en la placa precalentada. Luego incubarlo para solidificar la mezcla de membrana basal.

Una vez solidificada la matriz, añadir de dos a dos mililitros y medio de DMEM/F-12 avanzado, suplementado con los factores de crecimiento e inhibidores. Se aislaron las células tumorales y se establecieron organoides tumorales a partir de tejido fresco durante un período de 15 días. En ocasiones, los grandes volúmenes de restos celulares impiden la visualización precisa de los organoides tumorales en desarrollo.

Se observó que los organoides en desarrollo variaban fenotípicamente de cultivos aislados, redondeados a esferoides o agregados, según el origen del tumor. Los cultivos de organoides pueden estar contaminados por fibroblastos, un producto IP común del cultivo de células tumorales primarias. Después de aproximadamente siete días de cultivo, los fibroblastos migran desde las cúpulas de la matriz de la membrana basal y se adhieren a las placas celulares, lo que puede comprometer el crecimiento óptimo de los organoides.

Los cultivos de fibroblastos se establecen a partir de los restos de tejido recuperados del filtro. Las células migran fuera de los restos de tejido y se adhieren a las placas de cultivo.