Los cultivos organoides de ratón se asemejan más a la organización celular in vivo que a los cultivos celulares tradicionales. En la investigación del cáncer, los organoides modelan el tumor original mejor que las líneas celulares 2D y se pueden utilizar para probar posibles terapias oncológicas in vitro para desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos. Para la extracción en bloque del sistema urogenital del ratón macho agarrar la almohadilla de grasa a cada lado de la vejiga y tirar hacia arriba para exponer el testículo.
Diseccione cuidadosamente cada testículo lejos del resto de la región urogenital. Levante suavemente la vejiga para que la región urogenital esté elevada, exponiendo la uretra debajo. Mientras sostiene la vejiga, oriente las tijeras contra la parte inferior de la próstata dorsal para incitar a la uretra.
Toda la región urogenital se liberará de la cavidad abdominal. Después de extirpar el sistema urogenital, los ganglios linfáticos pélvicos situados inmediatamente detrás del sistema urogenital y a ambos lados de la columna vertebral quedarán expuestos. Para extirpar los ganglios linfáticos, oriente los fórceps rectos debajo del tejido linfático y tire hacia arriba.
A continuación, agarra el recto con los fórceps rectos y corta, tirando hacia arriba del recto para desentrañar todo el colon y el intestino delgado para buscar lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos mesentéricos. Cuando se ha eliminado todo el ilion, continúe tirando del duodeno para exponer el estómago. Corte el esófago para extirpar completamente el estómago.
Si se observan lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos, disecciona cuidadosamente estos ganglios lejos del intestino para su almacenamiento en PBS. Cuando se ha extirpado el estómago, el bazo se puede cosechar del lado dorsal del abdomen para su almacenamiento en 4%paraformaldehído. Retire el hígado para su almacenamiento en PBS.
Retire los riñones de cada lado de la columna vertebral junto con los ganglios linfáticos renales que contengan lesiones metastásicas. Para exponer la cavidad torácica cortar cuidadosamente el diafragma a lo largo de la caja torácica. La presión negativa liberada dentro de la cavidad torácica expondrá el corazón y los pulmones.
Tire hacia arriba en el esternón para abrir aún más la cavidad torácica. Escanee la cara ventral de la cavidad torácica a lo largo de la caja torácica en busca de lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos torácicos para la disección si está presente. Mientras mantiene el esternón, corte la caja torácica ventral para acceder al corazón y los pulmones y tire hacia arriba del corazón para cortar debajo de los pulmones.
Para extirpar completamente el corazón y los pulmones en bloque cortar todos los vasos sanguíneos anteriores en la tráquea. Transfiera cuidadosamente el corazón sin dañar el tejido pulmonar o las lesiones metastásicas pulmonares a un recipiente de PBS. Para la disección del tumor de próstata coloque la región urogenital bajo un microscopio de disección.
Usa un par de fórceps rectos y un par de fórceps curvos para voltear la región urogenital sobre su superficie dorsal. Localice la región proximal de la próstata que puede ser identificada por el color rosa-rojo de la uretra. Sujete la uretra firmemente para permitir la manipulación del tejido urogenital con los fórceps curvos.
Localice la base de las vesículas seminales para permitir su cuidadosa eliminación. A continuación, utilice el lado curvo de los fórceps para eliminar los deferentes de los vasos y tanto tejido graso y conectivo como sea posible. Mientras mantiene firmemente la uretra y la región proximal de la próstata, usa un par de tijeras finas puntiagudas para extraer la vejiga de la uretra.
Sosteniendo firmemente la región proximal de la próstata y la uretra con los fórceps rectos agarra la región prostática anterior con el lado curvo de los fórceps para alejar firmemente el tejido de la vejiga y el resto de la próstata. Coloque el tejido prostático anterior en PBS y localice la región de próstata ventral. Extirpar la región de próstata ventral de la misma manera.
Si la región lateral se puede distinguir de la región dorsal, elimine la región de próstata lateral en ambos lados. Luego extirpa la región dorsal de la próstata y coloca la región proximal de la próstata en 4%paraformaldehído. Después de picar, coloque las piezas del tumor en un tubo de 15 mililitros de tampón de digestión para una digestión de una hora y media a dos horas a 37 grados centígrados.
Al final de la digestión, sedimentar el tejido digerido por centrifugación y desechar el sobrenadante. Deslice el tubo para aflojar el pellet celular. Resuspender las células en un mililitro de trippsina precalentó suplementada con 10 micromolares Y-27632 inhibidor de ROCK durante cinco minutos a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación triturar la suspensión de tejido cinco veces con una punta de pipeta estándar P1000. Devuelva el tubo al baño de agua para una incubación adicional de cinco minutos y trituración. Para el revestimiento de la cúpula de matriz lavar las células digeridas en nueve mililitros de medio frío, a continuación, recoger las células por centrifugación.
Resuspender las células en un mililitro de medio fresco para el conteo. Y después de contar, recoger las células por centrifugación una vez más. Diluir las células tumorales en el volumen adecuado de matriz.
Deje caer cuidadosamente 200 microlitros de solución de células de matriz en cada pozo de una placa de seis pozos calentada de 55 grados Celsius. Deje que las cúpulas se solidificen a temperatura ambiente durante dos minutos antes de colocar la placa boca abajo en una incubadora de 37 grados Centígrados durante 20 minutos. Cuando las cúpulas han solidificado completamente añadir dos mililitros de medio organoides de próstata complementado con andrógeno R1881 e inhibidor de ROCK a cada pozo.
Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Las imágenes de disección fluorescente revelan proteína fluorescente verde, o expresión de GFP, por tumores sólidos de próstata, lo que indica que las células tumorales expresan Cre. El hígado y los pulmones del mismo animal presentan tumores metastásicos que expresan la GFP que demuestran que estos tumores se originaron a partir del tumor primario de próstata.
El ganglio linfático pélvico de este ratón expresa la GFP y no el tomate, lo que indica que este tumor metastásico ha superado el ganglio linfático y no queda tejido normal. En el primer día, los pequeños organoides generados a partir de un tumor sólido de próstata comienzan a formarse con células que expresan el tomate y la GFP presentes en el cultivo organoides tumoral. Sin embargo, en el día siete y más allá, cuando los organoides del tumor de próstata se han formado completamente, los organoides expresan la GFP, pero no el tomate, lo que sugiere que los organoides se han originado a partir de células tumorales que expresan Cre y no de células epiteliales normales.
En el primer día del cultivo de pequeños organoides generados a partir de tumor de próstata lleno de líquido, tanto el tomate como las células que expresan la GFP están presentes dentro del cultivo organoide. Sin embargo, los organoides de los tumores de próstata llenos de líquidos expresan GFP o Tomate en el día siete y más allá, lo que indica que los organoides se forman a partir de células que no expresan Cre. Para mantenerse orientado al cosechar el tejido prostático, tenga en cuenta las posiciones de la vejiga y la uretra en todo momento.
Después de su generación, los organoides se pueden utilizar en aplicaciones de imágenes, análisis de biología molecular y pruebas de fármacos.
