Este método es significativo porque los organoides derivados del paciente proporcionan una herramienta rápida y poderosa para estudiar los cánceres urológicos, ya que con frecuencia imitan la heterogeneidad genética y fenotípica de esta enfermedad multiespectro. Los organoides se pueden aislar de una cantidad limitada de material de biopsia del paciente y se pueden expandir rápidamente para el análisis posterior. Los organoides generados utilizando este protocolo se pueden utilizar tanto como modelos para ayudarnos a comprender las bases celulares y moleculares de los cánceres urológicos como herramientas de medicina de precisión para permitirnos predecir a qué tratamientos y pacientes individuales podría responder el cáncer.
Para comenzar, recoja una muestra de tumor macroscópicamente viable fresca de la cirugía y asegúrese de que la muestra esté sumergida en un medio de transporte en un tubo cónico estéril de 50 mililitros o en un frasco de muestra de orina durante el tránsito. Registre los detalles de la muestra, incluido el peso del tejido, la descripción de la muestra y los detalles sobre cualquier muestra de sangre y orina en la hoja de procesamiento de la muestra del paciente. Reemplace cuidadosamente el medio de transporte con 10 mililitros de medios basales y permita que el tejido tumoral se asiente por gravedad.
A continuación, con fórceps, extraiga el tejido tumoral y colóquelo en una placa de Petri estéril de 90 milímetros. Registre el peso del tejido en gramos o miligramos en la hoja de procesamiento de muestras clínicas y en la rejilla de disección. Luego, usando pinzas estériles en una hoja de bisturí desechable montada en un mango de bisturí, elimine el tejido no canceroso y las regiones necróticas macroscópicamente visibles.
Lave las piezas del tumor una o dos veces con DPBS frío, luego recójalas y transfiéralas a una nueva placa de Petri estéril de 90 milímetros. Tome una fotografía, dibuje un diagrama de tejido y planifique la disección de tejido en una cuadrícula de procesamiento clínico. Para el análisis histopatológico, coloque aproximadamente 50 miligramos del tejido tumoral en un casete de histología plástica desechable etiquetado.
Luego sumerja el casete histológico en un recipiente con un volumen de 5X a 10X de formalina tamponada neutra al 10% e incube durante la noche. Al día siguiente, reemplace la formalina con etanol al 70% para almacenarla a cuatro grados centígrados hasta que se pueda procesar el tejido. Para el análisis molecular, congele al menos una pieza tumoral en una RNasa, DNasa libre de 1,5 mililitros criovial utilizando nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados.
A continuación, dispense cinco mililitros de medio organoide en la placa de Petri de 90 milímetros que contiene las piezas tumorales restantes y picar mecánicamente el tejido lo más fino posible. utilizando una cuchilla de bisturí estéril número 10. Transfiera el tejido finamente picado a un tubo cónico de 50 mililitros y agregue cuatro mililitros de medio organoide, un mililitro de 10X colagenasa/hialuronidasa y 0,1 miligramos por mililitro de DNasa I para evitar la aglomeración celular.
Incubar el tejido tumoral picado en solución enzimática durante una o dos horas en un agitador o rotador orbitario en una incubadora para disociar fragmentos en una suspensión celular y descomponer los colágenos. Luego detenga la digestión agregando el doble del volumen de medio basal a la muestra. Centrifugar la muestra, aspirar y desechar el sobrenadante.
A continuación, para lisar los glóbulos rojos contaminantes, resusped el pellet en cinco mililitros de tampón de cloruro de amonio y potasio e incubar el tubo a temperatura ambiente durante tres minutos o hasta que se vea la lisis completa de los glóbulos rojos. Luego agregue 20 mililitros de medio basal en el tubo. Centrifuga de nuevo y aspira el sobrenadante.
En este paso, coloque una alícuota de 10 mililitros de medio organoide 2X y 1X en un baño de agua de 37 grados Celsius para calentar. Filtre la muestra primero a través de un colador reversible prehúmedo de 100 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros para eliminar el material insoluble grande. Luego filtre el eluido a través de un colador reversible prehúmedo de 37 micras para recolectar células individuales en pequeños grupos para el aislamiento de células individuales e inmunes.
A continuación, invierta el colador de 37 micras y agregue 10 mililitros de medios basales para recolectar grupos pequeños y de tamaño moderado. Rellene cada uno de estos nuevos tubos de 50 mililitros con DPBS a 40 mililitros, luego centrífique la suspensión y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 10 mililitros de medios basales al tubo que contiene las células individuales y cuente las células usando tinte de exclusión azul tripano en un contador celular automatizado.
Determinar el número de celdas y la viabilidad de las celdas. Centrifugue la muestra restante y reemplace el medio con solución de congelación celular o medios basales que contengan 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina y estreptomicina y 10% de DMSO, luego coloque las muestras en crioviales de 1.5 mililitros, guárdelas en un recipiente autocongelante e inmediatamente transfiera los recipientes a un congelador de menos 80 grados Celsius. Al día siguiente, transfiera los crioviales al almacenamiento criogénico en fase líquida o en fase aire para su almacenamiento a largo plazo.
A continuación, vuelva a suspender los grupos pequeños y de tamaño moderado recolectados con 500 microlitros de medio organoide 2X precalentado. Luego, con las puntas de pipeta de filtro estéril P-1000 heladas, agregue BME a las células y mezcle suavemente. Pipete rápida y cuidadosamente 100 microlitros de la mezcla BME de células reconstituidas a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano de fijación ultra baja, y coloque la placa en una incubadora durante 20 a 30 minutos para solidificarse.
Después de la incubación, agregue el medio organoide sobre la suspensión de células BME en una proporción de uno a dos dependiendo del volumen evaluado empíricamente, y coloque la placa en una incubadora durante 20 minutos para equilibrar. Después de la incubación, retire la placa de la incubadora y enséñela en un soporte de muestra en el escenario de un microscopio para evaluar visualmente los organoides bajo contraste de fase o configuraciones de campo brillante. Recargue el medio cada dos o tres días utilizando 50 microlitros de medio organoide precalentado para reponer los factores de crecimiento agotados y el volumen general.
Adquiera las imágenes de la serie de lapso de tiempo en los días 1, 2 y 3, y 5, 7 y 10 antes de la transmisión. La digestión de dos horas del tejido canceroso de vejiga con colagenasa/hialuronidasa y DNasa I disponibles comercialmente conduce a una digestión suficiente de 0,5 a 1 milímetro cúbico de piezas de tejido de biopsia de cistectomía más complejo, incluidas las células neoplásicas dentro de la lámina propia y las capas musculares de la vejiga. Los fragmentos post-digestión más grandes son adecuados para el cultivo y las placas de cultivo de tejidos estándar de cualquier tamaño para aislar nuevos cultivos bidimensionales.
Los organoides generados por este procedimiento se someten a un autoensamblaje dinámico, incluidas las fases de agregación, compactación y formación final de estructuras celulares apretadas. Histológicamente, estas estructuras recapitulan el tumor original del paciente. Los organoides generados en este procedimiento son adecuados para muchos propósitos, incluida la caracterización histopatológica adicional, los biobancos y las pruebas de eficacia de medicamentos.
Después de la generación de organoides, se pueden usar métodos adicionales para perfilar estos tumores, incluido el papel de las terapias contra el cáncer, el perfil metabólico o el perfil de transcripción. Dentro de este marco 3D, estas metodologías adicionales proporcionan una visión poderosa de la biología del cáncer de vejiga. Este método fue una base importante para los estudios que investigan la inmunooncología y el metabolismo celular.
