Para comenzar, apague la luz de la habitación. Seleccione Ocular debajo del panel ocular en el software FlowView. Cambie la torreta del cubo a cuatro TRITC y apague el controlador del panel táctil haciendo clic en apagado debajo de la luz de fondo del controlador del panel táctil en el software.
A continuación, apague la pantalla del ordenador. Abra la parte frontal de la cubierta de tela negra del microscopio. Tome el plato de 35 milímetros con fondo de vidrio que contiene los embriones de la caja negra y colóquelo en la platina del microscopio.
A continuación, encienda la unidad de iluminación de fluorescencia y utilice el ocular para identificar el embrión de interés. Enfócalo. Cierre la cubierta de tela negra para proteger la muestra de la luz.
Encienda la pantalla de la computadora para acceder al software que controla el microscopio. Cambie el ocular a LSM en el software para la adquisición de imágenes. Realizar la ablación con láser en embriones de control no estimulados utilizando un objetivo de inmersión en agua de 25 aumentos.
Haga clic en Bright Z, Sequence Manager y LSM stimulation en la ventana de herramientas. Establezca el tipo de escáner como Galvano y el tamaño de escaneo como 512 por 512. Encienda el canal uno y el canal tres debajo del panel de configuración PMT para permitir el uso del láser de 1040 nanómetros y haga clic en vivo cuatro veces la velocidad para visualizar el embrión.
Gire el embrión usando la función de rotación para orientar verticalmente el eje anteroposterior y establezca el zoom en tres. Dibuje una región de interés o ROI con la herramienta de forma en la configuración de escaneo y establezca el tamaño de ROI en el panel de referencia. A continuación, establezca el ROI en 512 píxeles de ancho y 100 píxeles de alto.
Para establecer los parámetros de adquisición de la pila Z previa a la ablación, registre la superficie del embrión como cero en la sección Z. Establezca el inicio en cero y el final en 100 micrómetros. Establezca el tamaño del paso en dos micrómetros y active el modo de adquisición Z marcando Z en la pestaña de la serie.
Con la función Z brillante, establezca la intensidad del láser de 1040 nanómetros para aumentar linealmente del 3 % al 7 %Guarde la configuración de imagen actual como la primera tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Para establecer los parámetros de adquisición de la película previa a la ablación, establezca un ROI de 512 por 512 píxeles cerca de la superficie ventral del embrión, como se demostró anteriormente. Establezca la intensidad del láser de 1.040 nanómetros en 3%Compruebe el tiempo y desmarque Z en el panel de la serie.
Mantenga el intervalo como ejecución libre debajo del panel de lapso de tiempo y establezca el ciclo como 10. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Para establecer los parámetros de la ablación con láser, defina una región 3D inmediatamente debajo de la membrana vitelina.
Establezca el inicio de la pila Z como el plano y el final como 20 micrómetros más profundos. Establezca el tamaño del paso en 1,5 micrómetros. Active el canal dos y el canal cuatro debajo del panel de configuración PMT para permitir el uso del láser de 920 nanómetros.
Establezca la intensidad del láser en 30% y configure la adquisición de imágenes con el láser para una sola pila Z dentro de la región 3D definida. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Para establecer los parámetros de adquisición para la película posterior a la ablación, configure la adquisición de imágenes para una película posterior a la ablación de un solo plano Z de 100 fotogramas utilizando los láseres de 1, 040 y 920 nanómetros.
Establezca la intensidad de los láseres en 3% y 0.3%Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Seleccione la secuencia en adquirir. Cambie la ruta de guardado de datos y el nombre del archivo según sea necesario.
Haga clic en listo y espere a que el software inicialice la canalización y, a continuación, haga clic en iniciar para ejecutar la canalización. para realizar la ablación con láser en embriones estimulados, establezca los parámetros de adquisición para la pila Z previa a la ablación como se demuestra para los embriones no estimulados. Guarde la configuración actual como la primera tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias.
Para establecer parámetros para la estimulación optogenética dentro de un ROI definido, cambie el zoom a uno y seleccione un ROI que cubra la superficie ventral del embrión. Apague los detectores del canal uno al canal cuatro, haga clic en Estimulación LSM, desmarque continuo dentro de la duración y escriba 12 segundos. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en estimulación en el Administrador de secuencias.
Establezca un tiempo de espera de tres minutos después de la estimulación para garantizar la inactivación total de la miosina y el desmontaje apical de la F-actina y lograr una morfología tisular estática antes de la ablación con láser. A continuación, establezca los parámetros de adquisición para la película de preablación de un solo plano Z como se demuestra para los embriones no estimulados, excepto que los láseres de 1, 040 y 920 nanómetros se utilizan para la adquisición de imágenes. Encienda los detectores del canal uno al canal cuatro.
Establezca la intensidad de los láseres en 3% y 0.3%Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Establecer parámetros para la ablación con láser como se demostró para los embriones no estimulados. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias.
Establezca los parámetros de adquisición para la película posterior a la ablación de un solo plano Z como se demostró para los embriones no estimulados. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en el Administrador de secuencias. Seleccione la secuencia en adquirir.
Cambie la ruta de guardado de datos y el nombre del archivo según sea necesario. Haga clic en listo y espere a que el software inicialice la canalización y, a continuación, haga clic en iniciar para ejecutar la canalización. En los embriones no estimulados sometidos a constricción apical, la mCherry de calabaza espagueti se enriqueció en la región apical medial, mientras que la mCherry negativa dominante de CRY2Rho fue citosólica.
En los embriones estimulados, la señal negativa dominante de mCherry CRY2Rho se localizó en la membrana plasmática, mientras que la señal apical medial de la mCherry de calabaza espagueti desapareció por completo. La ablación con láser de los embriones no estimulados dentro del dominio de constricción condujo a un rápido retroceso del tejido a lo largo del eje anteroposterior, mientras que la ablación con láser en los embriones estimulados no dio lugar a un retroceso tisular notable. La ablación se cuantificó y se muestra aquí.
