Nuestro protocolo ayuda a los científicos a analizar la red de actomiosina subcelular en células epiteliales individuales y también les permite realizar análisis similares a escala multicelular en tejidos epiteliales curvos. Nuestro protocolo es un buen ejemplo de una aplicación de Fiji. Tiene una interfaz gráfica de usuario intuitiva, y no requiere ningún conocimiento de scripting.
Por lo tanto, es muy adecuado también para los usuarios principiantes en el campo. Aunque nuestro método fue desarrollado para cámaras de huevo Drosophila, también es aplicable fuera de Drosophila epithelia. Animamos a los científicos a probar nuestro protocolo en sus sistemas modelo.
Utilice los archivos de prueba acompañados para familiarizarse con este protocolo. Le ayudará a decidir qué parte de este protocolo es adecuada para su pregunta de investigación individual. Esta parte del protocolo permite a los usuarios segmentar celdas epiteliales en películas de lapso de tiempo y, posteriormente, analizar pulsos de actomios en celdas individuales a lo largo del tiempo mediante el Administrador de superficies.
Para empezar, abra Fiji e importe la macro TissueCellSegmentMovie. ijm como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, abra un archivo TIFF corregido por lejía y divida los canales del archivo corregido por lejía yendo a la barra de menús, seleccionando Imagen, seguido de Color, y seleccionando Dividir canales.
Ejecute el script cargado en el canal de membrana celular activo de la película de lapso de tiempo seleccionada pulsando el icono Ejecutar en el script abierto. Para obtener una máscara de celda agradable, establezca el desenfoque gaussiano en 2.500 y la sensibilidad de detección de celdas a menos uno, y haga clic en Aceptar. A continuación, establezca la tolerancia de ruido estimada entre 10 y 20 para las películas de lapso de tiempo adquiridas con el objetivo 63x y haga clic en Aceptar. Aparece una máscara de celda generada en la película de lapso de tiempo analizada, aparece una nueva ventana llamada ParticleStack y también aparece una pequeña ventana llamada Acción requerida. Desde la máscara de celda de la película de lapso de tiempo, concéntrese solo en las celdas del centro y seleccione aquellas que puedan proporcionar contornos completos y bien definidos a lo largo de la película de lapso de tiempo.
Cuando las celdas seleccionadas en el centro se correspondan muy bien con las membranas celulares reales, guarde ParticleStack como un archivo TIFF. Abra el archivo TIFF de ParticleStack correspondiente en Fiji. Con el plugin Surface Manager instalado en Fiji, abre el plugin.
En el Administrador de superficies, haz clic en el botón Leer imagen de esquema y establece el índice Jaccard en 60%Carga de los contornos puede tardar varios minutos dependiendo del número de celdas. Una vez cargada, a cada celda se le asignará un número S y aparecerá en la parte izquierda de la ventana del Administrador de Surface. Haga clic en el número S seleccionado para que el contorno de celda importado de ParticleStack1.
tiff aparece en la película de lapso de tiempo. Compruebe cada número S importado para la calidad del contorno de celda en toda la película y elimine las celdas no deseadas que muestran contornos de celda incorrectos. Para eliminar una celda no deseada, resalte el contorno de la celda y haga clic en el botón Eliminar.
Utilice la herramienta Pincel para corregir contornos de celda. Cuando haya terminado, guarde las celdas corregidas como un RoiSet. archivo zip.
Para identificar si los pulsos de actomiosina están presentes en el tejido analizado y para entender el comportamiento detallado, así como la direccionalidad de las señales de actomiosina, comenzar abriendo Fiji. Abra una película de lapso de tiempo, cargue el ParticleStack1 guardado. Tiff cell mask y la película de lapso de tiempo corregida por lejía y, a continuación, cargue el complemento Surface Manager y la región de interés correspondiente desde el RoiSet.
archivo zip. A continuación, en Surface Manager, activa un canal con señales de interés. Haga clic en el botón Estadísticas para obtener la ventana denominada Valor gris medio Sector por sector.
Las intensidades medias y medianas de las señales de actomiosina se mostrarán con el tiempo en unidades arbitrarias, así como otros parámetros relacionados con el área y la forma de la celda. Guarde los valores como un archivo de hoja de cálculo yendo a la ventana Estadísticas, haciendo clic en Archivo y seleccionando Guardar como.De forma similar, genere una máscara de celda y cárguelo en el Administrador de superficies para analizar pulsos de actomiosina a escala de tejido. Esta parte del protocolo permite a los usuarios extraer selectivamente una fina capa de actomiosina en el tejido epitelial curvo con el tiempo.
Estos pasos son fáciles de usar y se basan en una interfaz gráfica intuitiva. Abra Fiji y asegúrese de que el complemento Elipsoid Surface Projection está instalado. A continuación, abra una película de lapso de tiempo y expórtela como un archivo XML/HDF5 haciendo clic en Plugins, yendo a BigDataViewer y seleccionando Exportar imagen actual como archivo XML/HDF5.
A continuación, abra el archivo exportado en Proyección de superficie elipsoide yendo a Plugins, haciendo clic en BigDataViewer, seguido de Proyección de superficie elipsoide y seleccionando Archivo XML. Esto abrirá una nueva ventana con vistas sagitales de la cámara de huevos, y aparecerá un cuadro de diálogo para guiar al usuario a través del procesamiento. La ventana de diálogo, denominada Proyección de ovarios, tiene varias pestañas.
En la primera pestaña de diálogo, denominada cuadro delimitador, defina los bordes x e y de una cámara de huevo en la película de lapso de tiempo junto con el ancho z del cuadro delimitador y pulse set. Las partes seleccionadas de la cámara de huevo se resaltan en rosa. A continuación, defina el tamaño de los blobs de señal en la pestaña de diálogo denominada buscar blobs en la ventana Proyección de ovarios.
Defina el sigma y el valor máximo mínimo. A continuación, presione calcular para identificar las señales de actomiosina, que aparecerán como blobs verdes. Vuelva a intentar este paso con diferentes parámetros hasta que se encuentren alrededor de 100 puntos.
Identificar las señales de actomiosina es un paso crucial. Depende de la calidad de la señal y del tamaño correcto de los blobs detectados. Si no hay manchas verdes visibles en la imagen, el siguiente paso no funcionará.
Para diseñar el elipsoide, continúe con la pestaña llamada elipsoide de ajuste. Establezca muestras aleatorias en 10.000, la distancia de corte exterior/interior en uno a 10 y, a continuación, haga clic en calcular. Después de esto, la pestaña llamada proyección se abrirá automáticamente y permite la definición de la extracción de superficie.
En la pestaña de proyección, configure una distancia de proyección mínima y máxima como la anchura del elipsoide deseado. La distancia de proyección mínima y máxima debe ajustarse para que la región elipsoidea definida en rosa incluya toda la capa exterior de la cámara de huevo. A continuación, defina la distancia de corte como una.
Asegúrese de que la región rosa del elipsoide con el definido con en la cámara de huevo es visible antes de presionar la computación. Ayuda a evaluar la calidad de un nuevo ajuste elipsoide. A continuación, establezca un ancho de salida del elipsoide en mayor o igual que 800 y un alto que sea mayor o igual que 400.
A continuación, establezca la duración de la extracción de superficie y elija una proyección esférica o cilíndrica. Si es necesario, voltee Z y alinee Y.Pulse compute para obtener una extracción de superficie para ambos canales en nuevas ventanas llamadas image. Ajusta el brillo y el contraste de las ventanas de imagen obtenidas para poder ver las señales de actomiosina proyectadas haciendo clic en Imagen, yendo a Ajustar y seleccionando Brillo/Contraste.
Si la extracción de superficie se ve bien, guarde ambos canales por separado como archivos TIFF. Además, guarde el archivo de ventana De registro para futuras referencias sobre cómo se extrajo la superficie de esta cámara de huevo en particular. A continuación, combine los canales con un código de color preferido en Fiji y guarde los resultados como archivos TIFF.
Este protocolo permite a los científicos investigar el comportamiento de las redes de actomiosina en los tejidos epiteliales. Esto sólo es posible cuando un análisis detallado del comportamiento de la actomiosina a escala celular local se combina con un análisis similar en la escala tisular. Aquí se muestran ejemplos representativos de comportamiento dinámico de miosina II a escala celular local y en la escala de tejido para el control y las cámaras de huevos Drosophila mutantes fat2.
En el plano único basal, la cadena de luz reguladora modificada verde de las señales de miosina II se mueve perpendicular al eje anterior-posterior de las cámaras de huevo de control. Esta polaridad se pierde en las cámaras de huevo mutante fat2 y conduce a pulsos de miosina II anisotrópica, oscilaciones A nivel de tejido, la cadena de luz reguladora modificada verde de miosina II en la muestra de control genera la fuerza sincronizada necesaria para promover la rotación epitelial. Por el contrario, el epitelio del folículo de una cámara de óvulo mutante fat2 pulsa fuertemente en el lado basal y no logra generar la fuerza sincronizada necesaria para promover la rotación epitelial.
En una delgada región apical de la cámara de huevo Drosophila, el mutante fat2 también se presenta con un comportamiento dinámico alterado de la cadena de luz reguladora verde modificado de la miosina II.Después de ver este video, usted debe tener una buena idea de cómo analizar una red de actomiosina a escala local y de tejido en cámaras de huevo Drosophila utilizando Fiji. Para obtener más consejos prácticos y solución de problemas, consulte la parte de discusión después del protocolo. Si tiene alguna pregunta relacionada con Fiji o nuestros plugins, consulte las páginas web respectivas o póngase en contacto con nosotros.
