Después de clonar el péptido nucleador de vesículas, o etiqueta de secuencia VNP, en el amino terminal de la proteína de fusión, cultive un caldo de lisogenia de cinco mililitros, o arrancadores LB, desde transformaciones bacterianas frescas a 37 grados centígrados hasta la saturación. Luego, úselo para inocular 25 mililitros de caldo excelente, o TB, que contenga la selección adecuada de antibióticos en un matraz cónico de 500 mililitros. Incubar el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados mientras agita a 200 rotaciones por minuto o más de lo que equivale a un tiro orbital de 25 milímetros hasta que el cultivo alcance un valor de densidad óptica de 600 nanómetros, o OD 600, de 0.8 a 1.0.
Luego, inducir la expresión de proteínas recombinantes del promotor T7 agregando IPTG a una concentración final de hasta 20 microgramos por mililitro u 84 micromolar. Después de dejar suficiente tiempo para la inducción, granular las células por centrifugación a 3000 G a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Pase el sobrenadante a través de un filtro PES de 0,45 micras estéril y sin detergente para esterilizar los medios que contienen vesículas para el almacenamiento a largo plazo.
Para concentrar las vesículas en un volumen más pequeño, pase la vesícula estéril que contiene medios a través de un filtro MCE estéril y sin detergente de 0,1 micras. Luego, lave suavemente la membrana con 0.5 a 1 mililitros de solución salina estéril tamponada con fosfato, o PBS, y use un raspador celular o esparcidor de plástico para eliminar cuidadosamente las vesículas de la membrana. Transfiera el concentrado de vesícula a un tubo de microcentrífuga fresco utilizando una pipeta.
Las vesículas purificadas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados. Sonicar la proteína que contiene vesículas en el medio estéril utilizando un programa apropiado para interrumpir las membranas lipídicas vesiculares y liberar proteínas. Centrifugar la suspensión sonicada a 39, 000 G y 4 grados centígrados durante 20 minutos para eliminar los residuos vesiculares.
BL21DE3 Escherichia coli que contenía la construcción de expresión VNp6-mNeongreen mostró fluorescencia mNeongreen inducida durante la noche con IPTG. La fluorescencia permaneció visible en el cultivo después de la eliminación de células bacterianas por centrifugación. La presencia de VNp-mNeongreen dentro del cultivo en medios de cultivo despejados se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio.
Las vesículas purificadas resuspendidas en PBS también mostraron fluorescencia.
