Para teñir la membrana de la vesícula, agregue el colorante lipídico fluorescente FM4-64 a las vesículas purificadas a una concentración final de dos micromolares e incube durante 10 minutos antes de la imagen. Después de aislar las vesículas llenas de proteínas del cultivo de Escherichia coli, pipetear las vesículas purificadas en una almohadilla circular de agarosa circular de menos de un milímetro de espesor al 2% LB que se ha dejado formar y colocar en un portaobjetos de vidrio limpio. Una vez que el líquido se haya secado, coloque un deslizamiento de cubierta de 50 milímetros por 25 milímetros sobre las vesículas en la almohadilla.
Sostenga el cubreobjetos en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva. Luego monte el portaobjetos en un microscopio invertido usando un objetivo de inmersión en aceite, y deje que la muestra se asiente durante dos o tres minutos y la temperatura se equilibre. Para imágenes de un solo fotograma, utilice un promedio de tres imágenes para reducir el ruido de fondo aleatorio dependiente del hardware.
Para las imágenes de lapso de tiempo, espere de tres a cinco minutos entre fotogramas individuales. Las imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio mostraron las vesículas que contenían verde amnios purificado. El colorante fluorescente lipofílico, FM4-64, confirmó la presencia de membranas vesiculares.
La microscopía de iluminación estructurada de las células bacterianas vivas que expresan la proteína de la membrana interna, CydB, fusionada con verde amnios, y VNp6-mCherry2 mostró producción de vesículas e inserción de carga.
