Para empezar, etiquete dos tubos de fax nuevos como tubos mixtos uno y dos. Prepare la célula y la suspensión de anticuerpos según la tabla dada para el análisis citométrico de flujo. Después de incubar los tubos durante 30 minutos, lave cada tubo dos veces con un mililitro de tampón para manchas.
Centrifugar los tubos en vórtice a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón de tinción. Cubra los pocillos de una placa de 48 pocillos con 200 a 500 microlitros de FBS y manténgalos durante una hora.
A continuación, pipetee de 200 a 500 microlitros de medios al 10 % de MSC después de eliminar el FBS residual. Para preparar las muestras para la clasificación de una sola célula, pipetee un mililitro de FBS en dos nuevos tubos de fax. Enrolla los tubos para crear una capa uniforme de FBS en la superficie interna del tubo.
Prepare la célula y la suspensión de anticuerpos en los tubos mixtos uno y dos, según la tabla, para el experimento de clasificación. A continuación, incubar los tubos en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con tampón de tinción, centrifugar los tubos a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón de tinción e incube durante 15 minutos en cinco microlitros de DAPI antes de clasificar. Para configurar la matriz de compensación, utilice los tubos de compensación de tinción simple. Haga clic en experimento en la barra de herramientas del software del instrumento.
A continuación, haga clic en configuración de compensación, seguido de crear controles de compensación. A continuación, haga clic en tubo sin teñir, seguido de parámetros en el cuadro de diálogo del citómetro. Ajuste los voltajes editando los valores de cada parámetro.
Haga clic en cargar en el panel de adquisición y, a continuación, haga clic en adquirir. Arrastre la puerta P-1 a la población de celdas y aplíquela en todos los controles de compensación para establecer el voltaje y la puerta negativa para cada parámetro. Ahora cargue los tubos de compensación de manchas individuales individualmente.
Registre los datos y guárdelos. Seleccione el experimento actual, haga clic con el botón derecho del ratón sobre él y seleccione calcular valores de compensación, seguido de enlace y guardar. Ejecute el tubo mixto y grabe 10.000 células.
Establezca las puertas de la población de interés que se va a clasificar con la estrategia de puerta adecuada. A continuación, cargue una placa colectora en el instrumento y establezca un número de celda objetivo, que oscile entre 2.500 y 5.000 celdas por pocillo. A continuación, seleccione la máscara de pureza de clasificación de una sola célula.
Recoja las poblaciones celulares clasificadas en un dispositivo de recolección, manteniéndolas en hielo durante la duración del experimento de clasificación. Finalmente, cambie las placas a una incubadora de dióxido de carbono al 5% para mantener los cultivos a 37 grados centígrados. Los gráficos de los ensayos multiparamétricos de citometría de flujo no mostraron expresión del isotipo FITC de los anticuerpos CD 90 FITC.
La expresión positiva de los marcadores CD-90 y CD-73 y la expresión negativa de CD-45 son comparables con la de sus controles no teñidos y FMO. Los inmunofenotipos mostraron la distribución de marcadores a partir de uno de los primeros pasajes con los marcadores recomendados por la ISCT y CD-44, determinando las poblaciones parentales como MSCs. Los cobertizos de paso tardío se utilizaron para la clasificación de células individuales de expresores altos y tenues.
Las células post-clasificadas colectadas en la placa de 48 pocillos mostraron adherencia y proliferación, al igual que su población parental. Las células post-clasificadas se diferenciaron en presencia de factores de crecimiento adipogénicos.
