La calidad de la suspensión monocelular preparada es crucial para obtener resultados fiables y de alta calidad para cualquier metodología ómica unicelular. Y este protocolo le mostrará cómo aislar células de forma rápida, suave y robusta incluso de tejidos muy desafiantes. La principal ventaja de este protocolo es el procesamiento aerodinámico de tejidos que permite la disociación tisular y el aislamiento de células de un gran número de muestras en poco tiempo con una calidad perfecta.
Aunque este método se desarrolló para dientes de ratón y humanos, también podría aplicarse para otros tejidos ricos en matriz extracelular, incluidos el cartílago, el hueso o el tejido conectivo denso. El procedimiento de aislar las pulpas dentales de los dientes humanos y especialmente de los dientes de ratón es un desafío manual. Aconsejamos a todos que prueben esto antes de que comiencen los experimentos reales.
Para comenzar, sostenga al ratón eutanasiado detrás de su cabeza mirando el aspecto ventral de su cabeza para que la cola apunte hacia otro lado. Usando las tijeras pequeñas y afiladas, retire rápidamente la piel de la mandíbula para exponer el arco mandibular, el tejido blando entre cada mitad de las mandíbulas y los músculos faciales adyacentes. Para hacer un corte profundo de cada lado de la mandíbula, primero corte a través del masetero a lo largo del lado bucal de la mandíbula hasta la articulación temporomandibular y luego corte a lo largo de la parte interna de cada mitad de la mandíbula a través de la base de la cavidad oral.
Corte todos los músculos y ligamentos a lo largo de la mandíbula hasta la articulación temporomandibular tanto desde el exterior como desde el interior de la cavidad oral. Agarre la mandíbula con las pinzas de punta doblada y retírela. Luego, con las tijeras, corte la sínfisis mandibular para dividir la mandíbula diseccionada en dos mitades.
Use una toallita industrial de baja pelusa para irritar el tejido blando restante de cada mitad de la mandíbula. Después de limpiar ambas partes de la mandíbula, colóquelas en una placa de Petri preparada previamente con HBSS helado. Para la disección de incisivos mandibulares, retire la cresta alveolar con los tres molares y agriete transversalmente el arco mandibular en el lugar correspondiente a la posición entre el primer y segundo molar.
Extraiga con cuidado el incisivo del resto del alvéolo dental. Si es necesario, retire los fragmentos restantes de hueso unidos al incisivo con pinzas y un bisturí. Coloque los incisivos disecados en HBSS fresco y helado.
Después de diseccionar el tejido de interés, coloque el tejido blando diseccionado en una gota de HBSS fresco y helado en medio de una placa de Petri de 10 centímetros mantenida en hielo. Usando una hoja de bisturí número 10 de forma redonda, corte el tejido en los trozos más pequeños posibles. Después de volver a agregar las piezas de tejido en el medio de la gota, corte repetidamente los agregados de tejido con la misma cuchilla de bisturí y repita este proceso hasta que el material esté lo suficientemente picado.
Transfiera las piezas de tejido trituradas con una punta de pipeta de un mililitro a una mezcla de digestión previamente preparada. Luego coloque el tubo en un ángulo de 60 grados y ajuste la velocidad a 150 a 200 RPM para garantizar movimientos de suspensión constantes dentro del tubo e incubar durante 15 a 20 minutos. Después de cada tres o cuatro minutos durante la incubación, titule vigorosamente la suspensión con una punta de pipeta de un mililitro para desintegrar todos los grupos.
Al final de la incubación, después de valorar la suspensión celular por última vez, agregue lentamente una solución de lavado en frío con hielo a un volumen final de 12 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y luego retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mililitros. Resuspend el pellet en la solución de lavado para lograr la concentración final de 700 a 1, 200 células por microlitro.
Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 50 micrómetros para eliminar los grupos o trozos restantes de tejido calcificado y mantenga el tubo en hielo hasta su posterior procesamiento. Luego, para la clasificación de células activadas por fluorescencia, cargue las células en un tubo preparado. Cargue el tubo en el clasificador de celdas y establezca una estrategia estricta de cierre para eliminar los desechos celulares, los dobletes y las celdas muertas como se describe en el manuscrito de texto.
En primer lugar, se utilizó la tinción de anticuerpos CD45 y el posterior análisis DE FACS para aclarar el número de células inmunes en la suspensión final de una sola célula. Como método complementario, se analizó el número total de células inmunes CD45 positivas en los datos de secuenciación de ARN unicelular. Utilizando FACS, se identificaron 14,44% de células CD45 positivas.
El análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula mostró que el 10,9% de las células que expresan CD45 y la disminución de las células en los datos de secuenciación de ARN de una sola célula podría ser causada por un umbral adicional durante el análisis de secuenciación. Las cosas clave son ser rápido y mantener este tejido o células en hielo siempre que sea posible. El número de células aisladas puede ser muy bajo, especialmente durante el aislamiento molar de ratón.
Evite la pérdida de células. Reducir el tiempo de aislamiento de una sola célula es muy importante para el éxito de todos los experimentos de una sola célula. Y este método específico realmente permitió reducir este tiempo y allanar el camino para el tipo de célula dental de alta calidad para sistemas de ratones y humanos.
