Para empezar, prepare una placa de agarosa al 1,8% con medio HEPES Buffered E3 o E3. Mientras trabaja bajo un microscopio de disección, coloque de seis a 10 larvas anestesiadas en una fila sobre la placa de agarosa. Coloque un alfiler de insecto en la cabeza de cada larva. A continuación, retire el E3 restante de la placa con un pañuelo de papel.
Con otro alfiler para insectos, aísle el intestino de una larva sin perturbar ningún otro órgano. Asegúrese de eliminar correctamente la yema. Una vez aislado, inspeccione el intestino y retire todo el material no intestinal, como la piel, la grasa o el hígado.
Use pinzas para recolectar el intestino y transferirlo a PBS que contenga un 10% de FCS en un tubo de microcentrífuga colocado sobre hielo. Inmediatamente después de la disección de todos los intestinos, centrifugue el tubo de microcentrífuga a 13, 800 g durante 30 segundos. Retire el sobrenadante, dejando unos 100 microlitros en el tubo para evitar que los intestinos se sequen.
Agregue 500 microlitros de solución de papaína a los intestinos en el tubo. Activa la papaína añadiendo 2,5 microlitros de cisteína molar. A continuación, incubar el tubo que contiene los intestinos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo hasta la mitad después de cinco minutos para estimular la digestión enzimática del tejido. Transfiera las células disociadas a un tubo de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) a través de un filtro de células de 35 micras previamente casado. Lave el colador varias veces agregando 0,5 mililitros de PBS que contengan un 10% de FCS a un volumen total de lavado de dos mililitros.
Centrifugar el filtrado recogido a 700 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados y eliminar el sobrenadante. Agregue un microgramo por mililitro DAPI a 300 microlitros de PBS que contengan 10% de FCS. Agregue esta mezcla al gránulo y vuelva a suspender para etiquetar las células muertas.
A continuación, incubar durante cinco minutos en hielo para permitir su exclusión durante el análisis posterior de FACS.
