Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).

Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell'Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L'uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un'approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi.
1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP)
<ol><li>Avviare l'allevamento di zebrafish wildtype e raccogliere 50 uova in terreno E3 tamponato con HEPES (di seguito denominato E3) in una capsula di Petri da 15 cm. Utilizzare questi pesci come controllo negativo per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FAC).</li>
	<li>Impostare l'allevamento di pesce zebra tg(phox2bb:GFP) e raccogliere circa 300 uova in E3 in una capsula di Petri da 15 cm.</li>
	<li>Conservare gli ovuli fecondati in E3 (massimo 50 uova/piatto) con un ciclo di luce/buio di 14 ore/10 ore, in un'incubatrice a 28,5 °C.</li>
	<li>A 1 dpf, rimuovere gli ovuli non fecondati e lasciare che quelli fecondati si sviluppino fino a 5 dpf.</li>
	<li>Selezionare le larve di tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissociazione di larve intere di tipo selvatico
<ol><li>Anestetizzare 5 larve dpf con lo 0,016% di tricaina.</li>
	<li>Tritare 30 zebrafish in piccoli pezzi usando una lama di rasoio in una capsula di Petri contenente 1 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA.</li>
	<li>Trasferire il pesce zebra tritato in una provetta per microcentrifuga con un volume totale di 2 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA e lasciare sul ghiaccio per 3 ore. Pipettare su e giù con una pipetta P1000 ogni ora per stimolare la dissociazione.</li>
</ol>3. Isolamento intestinale
<ol><li>Posizionare 6-10 larve da 5 dpf anestetizzate con tricaina allo 0,016% in fila, su una piastra di agarosio all'1,8% (0,45 g di agarosio in 25 mL di E3), sotto un microscopio da dissezione</li>
	<li>Metti uno spillo per insetti nella testa del pesce zebra.</li>
	<li>Rimuovere tutto l'E3 rimanente utilizzando un fazzoletto.</li>
	<li>Isolare l'intestino usando un altro spillo per insetti, senza disturbare gli altri organi. Assicurarsi che il tuorlo sia stato rimosso (Figura supplementare S1A).</li>
	<li>Una volta isolato, ispezionare l'intestino e rimuovere tutto il materiale non intestinale (ad es. pelle, grasso, fegato) se necessario.</li>
	<li>Raccogliere l'intestino con una pinzetta e metterlo in una provetta per microcentrifuga, contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), su ghiaccio. NOTA: È necessario isolare un minimo di 244 intestini, mantenendo il tempo totale di dissezione a 3 ore. Questo è fattibile con due persone che lavorano in parallelo.</li>
</ol>4. Dissociazione intestinale
<ol><li>Subito dopo la dissezione di tutti gli intestini, centrifugare la provetta per microcentrifuga alla massima velocità (13.800 × g) per 30 s.</li>
	<li>Rimuovere il PBS/10% FCS ma lasciarne una piccola quantità (~100 μL) per evitare che l'intestino si secchi. Aggiungere 500 μL di papaina 2,17 mg/mL in HBSS contenente CaCl2 e MgCl2 per dissociare le cellule.</li>
	<li>Attivare la papaina con 2,5 μL di cisteina (1 M).</li>
	<li>Incubare le budella a bagnomaria a 37 °C per 10 min. Pipettare su e giù a metà (dopo 5 minuti) per stimolare la digestione enzimatica dei tessuti.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una provetta FACS utilizzando un filtro cellulare da 35 μm, prebagnato con 0,5 mL di PBS/10% FCS.</li>
	<li>Lavare il filtro aggiungendo un totale di 2 mL di PBS/10% FCS con incrementi di 0.5 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di PBS/10% FCS.</li>
	<li>Aggiungere 1 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare le cellule morte (1:1.000) e incubare per 5 minuti per consentirne l'esclusione durante la FACS.</li>
</ol>5. Arricchimento FACS
<ol><li>Utilizzare il campione wildtype per impostare le porte della popolazione cellulare ordinata registrando 3.000 cellule sul citometro a flusso (Figura supplementare S1B-E).</li>
	<li>Utilizzare un ugello da 100 μm, impostare la precisione di ordinamento sulla purezza e inserire la provetta di raccolta contenente 200 μL di PBS/5% FCS nella macchina FACS.</li>
	<li>Caricare la sospensione cellulare dell'intestino e selezionare le singole cellule vive (DAPI-negative) nella provetta di raccolta (Figura 2C), escludendo i doppietti (Figura 2B) e le cellule morte (Figura 2C). NOTA: Per il pesce zebra tg(phox2bb), la proporzione di cellule GFP+ viene controllata solo come riferimento, poiché tutte le singole cellule vive vengono ordinate.</li>
	<li>Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio dopo lo smistamento delle cellule.</li>
	<li>Contare la sospensione cellulare con un emocitometro, incluso un controllo di vitalità con blu di tripano. Se la fattibilità è almeno dell'80%, continuare con il passaggio successivo.</li>
	<li>Le cellule sono ora pronte per l'elaborazione per scRNAseq (cioè la piattaforma 10x Genomics Chromium). Utilizzare circa 20.000 cellule per campione.</li>
</ol>

Elaborazione di cellule intestinali da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola

<ol>
	<li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system,+immune+system,+and+epithelium+eesponses.">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li><li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Gastrointestinal System. , (2014).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system.">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li><li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes.">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li><li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li><li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li><li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuromyopathies:+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish.">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li><li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish.">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li><li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg(-8.3bphox2b:Kaede)+transgenic+zebrafish.">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li><li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease.">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level.">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070 (2023).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver.">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290 (2022).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification.">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li><li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine.">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).</li><li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).</li><li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia.">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li><li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres.">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento e la dissociazione dell'intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un'indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che...

Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti, nonché dell'eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l'assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l'asse intestino-cervello e l'ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica 6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l'ENS 6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.
Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l'ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger v3.0.2</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#D-9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus SZX16</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III sorter machine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222, Tricaine</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat v3</td>
			<td>Stuart et&#160;al. (2019)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat#T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gut isolation from zebrafish larvae for single-cell rna sequencing

Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l'importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell'intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.

The gastrointestinal (GI) tract is a complex system that plays a vital role in overall health and well-being. It is responsible for the digestion and absorption of nutrients, as well as the elimination of waste products1,2. The GI tract is composed of multiple cell types, including epithelial cells, smooth muscle cells, immune cells, and the enteric nervous system (ENS), which communicate closely together to regulate and maintain proper intestinal function3,4,5. Defects in the development of the GI tract can have far-reaching effects on various aspects such as nutrient absorption, microbiota composition, the gut-brain axis, and the ENS, leading to several enteric neuromuscular disorders, such as Hirschsprung disease and Chronic intestinal pseudo-obstruction6,7. These disorders are characterized by severe gut dysmotility caused by alterations in various key cells, such as the interstitial cells of Cajal, smooth muscle cells, and the ENS6,8,9. However, the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction are still poorly understood.
The zebrafish is a valuable model organism for studying GI development and dysfunction due to its rapid embryonic development, transparency during embryonic and larval stages, and genetic tractability10,11,12,13,14. Numerous transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins are available. An example of such a line is the tg(phox2bb:GFP) zebrafish, commonly used to study the ENS, as all phox2bb+ cells, including enteric neurons, are labeled15,16. Here, using the tg(phox2bb:GFP) zebrafish line, we present a method for intestinal isolation of 5 days post fertilization (dpf) larvae for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis (Figure 1).

Autore in primo piano: Isolamento e analisi delle cellule intestinali delle larve di zebrafish per lo studio degli aspetti trascrittomici dello sviluppo gastrointestinale 

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l'isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Intestinal Cells of Zebrafish Larvae for Investigating Transcriptomic Aspects of Gastrointestinal Development at JoVE.com

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

La nostra ricerca mira a indagare i cambiamenti trascrittomici che si verificano durante lo sviluppo e la disfunzione gastrointestinale nelle larve di zebrafish. Qui, forniamo un nuovo protocollo che consente l'isolamento di diversi tipi di cellule all'interno dell'intestino del pesce zebra, che ha potenziali applicazioni nella comprensione della salute e delle malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'esplorare l'interazione tra il sistema nervoso enterico e altri tipi di cellule intestinali durante lo sviluppo e la malattia.La comprensione di queste dinamiche complesse utilizzando tecniche avanzate come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha il potenziale per rivelare informazioni critiche sulle neuromiopatie enteriche, portando a diagnosi e trattamenti più precisi. Utilizzando questo protocollo, abbiamo identificato con successo vari tipi di cellule intestinali, tra cui epiteliali, stromali, del sangue, dei muscoli, delle cellule immunitarie e persino dei neuroni enterici e della glia, che non sono mai stati catturati prima a questa quantità utilizzando approcci simili. Pertanto, forniamo una tecnica affidabile per studiare la composizione gastrointestinale durante lo sviluppo e la disfunzione.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

1.1K Views.  Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital. La nostra ricerca mira a indagare i cambiamenti trascrittomici che si verificano durante lo sviluppo e la disfunzione gastrointestinale nelle larve di zebrafish. Qui, forniamo un nuovo protocollo che consente l'isolamento di diversi tipi di cellule all'interno dell'intestino del pesce zebra, che ha potenziali applicazioni nella comprensione della salute e delle malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'esplorare l'interazione tra il sistema nervoso ...

Video: Autore in primo piano: Isolamento e analisi delle cellule intestinali delle larve di zebrafish per lo studio degli aspetti trascrittomici dello sviluppo gastrointestinale 

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.