Para comenzar, descongele el vial criogénico del PBMC en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos mientras lo invierte suavemente. A continuación, transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el vial criogénico con un mililitro de medio de crecimiento completo tibio y agregue la solución gota a gota a las células en el tubo cónico para realizar el primer paso de dilución.
Ahora centrifuga la suspensión celular durante cinco minutos e inclina el tubo cónico con fluidez para eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en tres mililitros de medio de crecimiento completo tibio. Para el recuento de células, mezcle 10 microlitros de suspensión celular con azul de tripán.
Cuente las células utilizando 10 microlitros de solución celular teñida, ya sea con un contador celular automatizado o una cámara celular. Utilice un medio de crecimiento completo tibio para diluir las células y lograr una concentración final de una vez 10 a la sexta célula por mililitro. A continuación, siembre 100 microlitros de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos.
Agregue 100 microlitros de la dilución del fármaco dos veces a cada pocillo. Para recolectar las células, centrifugue la placa de cultivo celular durante 10 minutos. Utilice una bomba de vacío para eliminar el sobrenadante mientras coloca la punta de la bomba en la esquina inferior del pocillo para retener las células.
Ahora agregue 200 microlitros de PBS helado a cada pocillo. Después de centrifugar la placa durante cinco minutos, retire el sobrenadante. Luego agregue 15 microlitros de tampón de lisis a cada pocillo.
Con una película adhesiva de sellado, selle la placa para protegerla contra la contaminación. Agite la placa y centrifugérela durante un minuto. Por último, recoja seis microlitros de la solución celular lisada en una placa de PCR.
