Este protocolo proporciona un método para producir varios cientos de esferoides tumorales multicelulares en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos adecuada para la microscopía automatizada. El esferoide producido se puede clasificar en diferentes clases de tamaño, y la información subcelular se puede extraer de cada célula. La técnica produce suficientes sueros que se pueden utilizar en el cribado directo y en estudios de interferencia de ARN.
Diluya el material del basamento de ECM en medio libre de suero rojo de fenol frío utilizando puntas preenfriadas mantenidas a menos 20 grados centígrados. Apuesto 15 microlitros del material del sótano ECM y la solución mediana en una placa de imagen de 96 pozos. Centrifugar la placa durante 20 minutos a 91 veces G a cuatro grados centígrados.
Incubar la placa durante no más de 30 minutos a 37 grados centígrados. Agregue viajes y EDTA a las celdas. Incubamos las células a 37 grados centígrados al final de la incubación, suspendemos las células en un medio completo que contiene 10% fbs.
Pipetear 10 microlitros de la suspensión celular, en una cámara de conteo de hemocitómetros. Cuente el número de celdas en cuatro cuadrantes de la cámara. Centra ve las celdas a 135 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente.
Una vez que estas células se peletizan, aspiran el sobrenadante y resuspenden las células en un medio completo libre de fenol rojo para obtener una concentración de 10 a las seis células por mililitro. Diluir las células en un medio completo libre de fenol rojo. Vea las células gota a gota en un movimiento circular en un volumen total de 35 microlitros por pozo.
Incubar las células durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. A 1,2 microlitros de material de basamento ECM a 23,8 microlitros de medio completo libre de fenol rojo por pozo, lo que resulta en un volumen final de 60 microlitros por pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, reemplace el medio con 100 microlitros de medio completo libre de fenol fresco. Inserte la placa de 96 pocillos que contiene esferoides en un microscopio de detección confocal de alto contenido. Seleccione los láseres apropiados para excitar los pisos utilizados.
Adquiera los canales secuencialmente para evitar la diafonía, imagine los esferoides utilizando los objetivos apropiados. Para analizar la morfología de los esferoides, segmentar los esferoides en función del FLoide conjugado fluorescentemente y la tinción. Segmentar los núcleos en función de la tinción hexagonal tres, tres, tres, cuatro, dos.
Segmentar el citoplasma de cada célula por el hexadecimal residual tres, tres, cuatro, dos, tinción que está presente en el citoplasma celular. Calcular las diferentes propiedades morfológicas de los esferoides incluyendo el volumen, el área de superficie, la esfericidad y el número de núcleos por sus esferoides. Ross tiene imágenes adicionales para eliminar esferoides de menos de 75 micrómetros cúbicos y más de 900. 000 micrómetros cúbicos.
Para analizar una sola célula dentro de los esferoides, segmente los esferoides en función de la tinción esferoide conjugada fluorescentemente. Segmentar los núcleos en función de la tinción hexagonal tres, tres, tres, cuatro, dos. Segmentar el citoplasma de cada célula por el hexágono residual tres, tres, tres, cuatro, dos tinción que está presente en el citoplasma celular.
Segmentar los lisosomas en función de la tinción secundaria de anticuerpos. Calcular las diferentes propiedades morfológicas de las células dentro de cada esferoide, incluyendo el número de lisosomas por célula, el volumen celular y el área de superficie celular. La figura muestra bien vistas generales de tres tipos diferentes de esferoides, incluidas imágenes en diferentes planos confocales.
También se muestra una vista volumétrica de todos los esferoides. La figura muestra el proceso de segmentación del pH, el panel A muestra todos los esferoides en una vista volumétrica. El panel B muestra la segmentación del conjunto del citoplasma, los núcleos y los lisosomas dentro de todas las células de un solo esferoide.
El citoplasma y los núcleos se segmentan en función de la tinción hexagonal tres, tres, tres, cuatro, dos. Y los lisosomas se segmentan en función de la tinción de anticuerpos anti lab one. Los paneles C muestran el mismo segmentado que el panel B, pero en una vista de tres llanuras.
Se pueden realizar diversas mediciones morfológicas a nivel de esferoides. Estas mediciones incluyen el cálculo del número de núcleos por esferoides, así como de estos Felicity, volumen y área de superficie del pH. El volumen típico de cada célula en los tres tipos de esferoides.
Así como el número de lisosomas por célula se muestran en esta figura. La optimización de la densidad inicial de asientos de celdas al comienzo de la generación de SP es un paso crítico. La figura muestra que agregar demasiadas células aún permite la formación de esferoides.
Sin embargo, esto puede resultar en la fusión de esferoides. Los esferoides producidos de esta manera pueden ser sometidos a análisis transcriptómicos y proteómicos. Esta técnica se utiliza para analizar cuantitativamente la absorción de la administración de fármacos tales nanopartículas y evaluar su toxicidad para las células individuales en los esferoides.
