Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E^-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9

La deleción genética de Kinesin-7 y CENP generalmente resulta en la detención del ciclo celular y la muerte celular. La construcción de líneas celulares estables de CENP knockout es una importante cuestión no resuelta en la biología de CENP. En este estudio, generamos células HeLa knockout de CENP utilizando un sistema CRISPR/Cas9 y establecimos tres estrategias de cribado optimizadas.

Recientemente, varias tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción y la forma en que fabricamos nuestras nucleasas, se han diseñado para escindir genomas en un tamaño específico. La tecnología de eliminación del gen CRISPR/Cas9 ha revolucionado la biología básica, la biotecnología y la medicina. El CENP es esencial para unir los cinetocoros a los microtúbulos y alinear los cromosomas.

La interrupción de CENP, ya sea a través de microinyección de anticuerpos, deleción de sgRNA, inhibición química o deleción genética, da lugar a una desalineación cromosómica, defectos mitóticos y, a menudo, a la muerte celular, lo que complica el estudio de los mecanismos de la proteína CENP. En este estudio, se establecieron tres estrategias optimizadas de cribado basadas en el fenotipo, que incluyen el cribado de colonias celulares, la alineación cromosómica de fenotipos y las intensidades fluorescentes de las proteínas CENP, lo que mejoró la eficiencia del cribado y la tasa de éxito experimental. Es importante destacar que la deleción de CENP da lugar a una desalineación cromosómica, a la localización anormal de las proteínas BubR1 y a defectos mitóticos.

Los modos de interacción y los mecanismos moleculares de CENP y sus inhibidores son campos de investigación importantes en biología celular e investigación del cáncer. En este estudio, la línea celular HeLa knockout de CENP se ha establecido como una herramienta valiosa para la validación de la especificidad y la toxicidad de los inhibidores de CENP.