La langosta migratoria es una prueba agrícola importante. Este método proporciona un protocolo eficiente y fácil de producir para los métodos de presión génica de la Es un método sistemático y detallado de una construcción CRISPR / CAS9 de mutantes de langosta homocigota, incluida la recolección de huevos, la detección de mutantes y el mantenimiento homocigótico. Para comenzar, prepare las agujas de inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas.
Establezca los parámetros como se describe en el manuscrito de texto, luego muele la punta de la aguja de inyección con un micro molinillo. Preparar la proteína ribonucleo para la inyección mezclando un microlitro de proteína Cas9 con un microlitro del ARN guía único verificado. Luego agregue ocho microlitros de agua estéril libre de ARN para hacer el volumen final de la mezcla, 10 microlitros.
Mezcle bien la solución y colóquela en hielo. A continuación, recoja las vainas de huevo recién puestas de la vaina de posición de los óvulos y espere el bronceado del huevo. Después de 30 minutos, use un cepillo fino para aislar los huevos de las vainas de huevo en agua y lave los huevos tres veces con agua estéril.
Luego coloque los huevos en una placa de Petri y agregue agua estéril para mantenerlos húmedos. Llene la aguja de inyección con la solución de proteína ribonucleo preparada y cargue la inyección en el micromanipulador. Establezca los parámetros de microinyección como 300 Hectopascales de presión de inyección, 0,5 segundos de tiempo de inyección y 25 Hectopascales de presión de compensación.
Cuando se ajusten los parámetros, presione el pedal para evaluar el volumen de la solución inyectada. Ajuste la presión de inyección y el tiempo de inyección para asegurarse de que el volumen de inyección sea de aproximadamente 50 a 100 nanolitros. Después de colocar los huevos estériles regularmente en la almohadilla de inyección, coloque la almohadilla en la mesa de objetos del microscopio y ajuste el aumento del microscopio hasta que se observen los huevos.
Luego ajuste la aguja de microinyección bajo el microscopio hasta que se pueda ver la punta de inyección y coloque la punta cerca del huevo que se inyectará. Comience la inyección a una altura adecuada y en un ángulo de 30 a 45 grados. Inserte la punta en el huevo cerca de las micro pilas del huevo y presione el pedal para realizar la inyección.
A continuación, retraiga la aguja rápidamente y mueva la almohadilla de inyección para inyectar el siguiente óvulo. Transfiera los huevos inyectados a una placa de cultivo con un trozo de papel de filtro húmedo. Colóquelos en una incubadora a 30 grados centígrados.
Después de la inyección, verifique el desarrollo de los óvulos inyectados todos los días. Transfiera los huevos inyectados a una nueva placa de cultivo cada 24 horas en los primeros cinco días. En el sexto día después de la inyección, recoja y transfiera al azar 10 huevos a un tubo y muele adecuadamente los huevos con dos bolas de acero a 60 hercios durante seis minutos con un molinillo.
Después de moler, vuelva a suspender los residuos en un mililitro PBS. Luego transfiera cinco microlitros de la mezcla resuspendida a 45 microlitros de hidróxido de sodio 50 milimolar para lisarse a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Para terminar la reacción de lisis alcalina, agregue cinco microlitros de una solución molar de clorhidrato de Tris en el sistema de lisis.
Tome un microlitro del producto de lisis como plantilla de PCR para amplificar el fragmento del gen diana. Después de la PCR y la secuenciación, compare los resultados de la secuenciación con la secuencia de tipo salvaje para evaluar si el sistema CRISPR / Cas9 escindió el gen objetivo in vivo. Permitir el resto de los huevos para su posterior desarrollo ya que los indeles se detectan en la etapa embrionaria.
Después del desarrollo, la transferencia y el cultivo de las ninfas eclosionadas en una jaula de cría como se describe en el manuscrito. Cuando las ninfas se desarrollen hasta la quinta etapa de estadio, sepárelas con vasos de cultivo de plástico. Realizar cruzamientos utilizando los mutantes G0 y langostas de tipo salvaje.
Después de recolectar oassists, use de tres a seis óvulos desarrollados en cada oassist para detectar mutaciones como se describió anteriormente. Mantener los oassists de mutación positiva para el desarrollo posterior y abandonar los oassists negativos para mutación. Para la criopreservación, lave los huevos con agua estéril e incubarlos en un plato de cultivo como se explicó anteriormente.
Después de cinco a seis días, reúna los huevos en la placa de cultivo y cúbralos con fragmentos de papel de filtro. Luego envuelva todo el plato de cultivo con una película de parafina. Coloque el plato a 25 grados centígrados durante dos días, seguido de otros dos días a una temperatura más baja de 13 a 16 grados centígrados.
Luego transfiera el plato a un refrigerador de seis grados centígrados. Agregue agua al plato cada dos semanas para proporcionar un ambiente húmedo para los huevos. Finalmente, para resucitar los huevos criopreservados, coloque la placa de Petri a 25 grados centígrados durante dos días.
Más tarde, coloque los huevos en una incubadora de 30 grados centígrados hasta que las ninfas eclosionen. En este estudio, el sitio objetivo para el sistema CRISPR / Cas9 se localizó en el primer exón. En el ensayo de escisión Cas9, la proteína ribonucleo CRISPR/Cas9 pudo digerir el fragmento de PCR que contiene el sitio objetivo con una tasa de escisión de aproximadamente el 55%Los resultados de la secuenciación para la estimación de la tasa de mutación en estadio embrionario sugirieron una edición eficiente del genoma en el sitio objetivo.
La eficiencia de edición resultó en una tasa de eclosión de ninfas del 52,73% y el 66,67% de los adultos G0 eran mutantes en mosaico. La estrategia de paso de las líneas mutantes se muestra aquí. El exceso de huevos homocigotos fue criopreservado para mejorar la tasa de utilización de los homocigotos.
Aunque la tasa de eclosión de los huevos criopreservados se redujo con la extensión del tiempo de criopreservación, las acciones correctivas, como la aplicación de fragmentos de papel de filtro y la recuperación de estos huevos preservados con un gradiente de aumento de la temperatura, fueron útiles para la reanimación. Lo más importante es tratar de limitar el daño mecánico causado por la microinyección. Este procedimiento se puede utilizar como referencia para la obtención de otros insectos.
Parte de algunos detalles como los métodos de recolección de huevos, inyección y el cultivo deben modificarse. Esta técnica también puede ser útil para estudiar la metamorfosis y la adaptación ambiental de los insectos y la construcción de mutantes de langosta homocigota aceleró la investigación en este campo.
