Para comenzar, prepare el tampón 2X para RT-qPCR en agua libre de DNasa/RNasa. Guarde el tampón a menos 20 grados centígrados hasta su nuevo uso. A continuación, mezcle los cebadores y las sondas en un tubo de 1,5 mililitros.
Compensar el volumen con tampón de elución. A continuación, guarde el tubo a menos 20 grados centígrados. Prepare una mezcla de enzimas con Taq polimerasa y M-MLV RT en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo.
Recupere el volumen con el tampón de almacenamiento de polimerasa Taq. Ahora vuelva a suspender los ARN sintéticos virales en tubos separados con 100 microlitros de tampón Tris-EDTA para hacer existencias de 10 a la sexta copia de ARN por microlitro. Para mezclar las existencias de virus, agregue cinco microlitros de influenza A y B del SARS-CoV-2 a 50 microlitros de tampón Tris-EDTA.
Del mismo modo, mezcle el SARS-CoV-2 y el MERS-CoV para obtener una segunda mezcla viral. Diluir ambas mezclas diez veces para obtener una dilución final de 10 copias de ARN por microlitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, pipetee tampón 2X, cebador, enzima, agua libre de DNasa/RNasa y las mezclas de ARN correspondientes.
Selle la placa con un sello adhesivo para placas. Luego centrifuga la placa durante un minuto para recoger el líquido en el fondo del pozo. A continuación, programe la máquina de PCR para que acepte el tipo de bloque rápido de 96 pocillos con el tipo experimental establecido en la curva estándar.
Establezca los reactivos en Reactivos TaqMan y seleccione las propiedades de ejecución estándar. Definir las dianas génicas y el colorante reportero. A continuación, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar y asigne objetivos y muestras al diseño de la placa.
Ahora, ingrese el programa de ciclo en el instrumento. Transfiera la placa a la máquina de qPCR en tiempo real en la orientación correcta y presione ejecutar para iniciar el ciclo. Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales.
A continuación, examine los gráficos de amplificación proporcionados por el programa qPCR. Los dos kits desarrollados fueron capaces de amplificar con éxito los tres genes diana simultáneamente con tan solo 10 copias de ARN por reacción. Las eficiencias de amplificación para todas las titulaciones virales fueron superiores al 99%
