Para empezar, aislar y cultivar la capa externa de la aorta y la primera rama de las arterias mesentéricas aisladas del ratón anestesiado. Una vez que las células tengan un 80% de confluentez, centrifugar la suspensión celular disociada a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante por completo y resuspender el pellet celular en 98 microlitros de tampón de clasificación por cada 10 millones de células totales. Después de la adición del anticuerpo CD34, incubar las células en la oscuridad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Para lavar las células, agregue dos mililitros de tampón de clasificación a las celdas y centrifugue a 300 g durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 80 microlitros de tampón de clasificación. A continuación, añada 20 microlitros de MicroBeads Anti-FITC a la suspensión celular.
Después de lavar y centrifugar las células como se demostró anteriormente, vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de clasificación. A continuación, coloque una columna de separación magnética dentro del campo magnético de un separador y coloque un tubo colector debajo de la columna. Después de enjuagar con 500 microlitros de tampón, cargue la suspensión de celdas en la columna y recoja el flujo a través de las celdas sin etiquetar que contienen en el tubo de recolección.
Retire la columna del separador y colóquela en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mililitros. Introduzca 500 microlitros de tampón de clasificación en la columna y empuje el émbolo en la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente.
