Nuestro protocolo está optimizado para el modelo de ratón y utiliza materiales que están fácilmente disponibles para todos los investigadores. Esta técnica se puede aplicar a modelos de ratón sanos, enfermedades o alterados genéticamente. Nuestro protocolo permitirá a los investigadores responder a cualquier pregunta sobre la biología de pericitos cardíacos a partir de cualquier modelo de ratón de enfermedad o variación genética.
Este procedimiento proporcionará información sobre la biología de pericitos cardíacos y nos ayudará a entender su contribución a la homeostasis cardíaca y la hemodinámica tanto en la salud como en la enfermedad. Coloque el ratón anestesiado en la posición supina y pegue sus extremidades delanteras. Abra cuidadosamente la cavidad torácica y canule la aorta descendente usando una aguja de mariposa de calibre 25.
Haz un nick en la aurícula derecha. Luego, perfunde el corazón con al menos 20 mililitros de 250 unidades por mililitro heparinizado, libre de calcio-magnesio Dulbecco amortiguado solución salina a dos mililitros por minuto con una bomba peristáltica de flujo variable. La perfusión se completa cuando el PBS limpio sale de las aurículas correctas.
Corta el corazón en la aorta y colólo en el DPBS helado libre de calcio y magnesio. Luego, transfiera el corazón a una placa Petri de 15 por 15 centímetros. Corta el corazón en trozos diminutos usando tijeras de resorte y fórceps de punto fino con suficiente solución enzimática para cubrir las piezas.
Ahora, transfiera las piezas y la solución a un tubo cónico de 50 mililitros, y selle con película de plástico de parafina. Incubar a 37 grados centígrados en un agitador orbital a 120 rpm durante 75 minutos. Después de la digestión de la colagenasa con la solución enzimática, decantar el líquido a través de un colador celular de 100 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros, dejando suficiente solución para que las piezas no se sequen.
Usando fórceps de punto fino, tome el tejido del tubo y coloque algunas piezas en una diapositiva del microscopio. Luego, muele el tejido entre dos diapositivas de microscopio para romper el tejido. Enjuague las diapositivas con medios de cultivo libres de enzimas en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
Repita este paso hasta que todas las piezas de tejido estén disociadas. Combine la solución tensada y el tejido molido en un tubo. Colar la suspensión resultante a través de un colador celular de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
Centrifugar la muestra a 220 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar la solución anterior y resuspender suavemente el pellet celular en tampón de tinción FACS frío que contiene DPBS y albúmina sérica bovina. Cuente las celdas y compruebe la viabilidad utilizando un contador de celdas.
Diluir las células a un millón de células por mililitro con tampón de tinción FACS frío que contiene DPBS y albúmina sérica bovina. Las celdas están listas para ser manchadas y ordenadas. Prepare y etiquete tubos FACS de cinco mililitros para todos los controles y muestras celulares.
Aliquot un mililitro de células por tubo para una muestra no manchada, fluorescencia menos uno controles, y controles de isotipo coincidentes. Utilice las celdas restantes para la ordenación. Todos los controles y muestras se pueden preparar y teñir al mismo tiempo.
Además, prepare y etiquete tubos FACS de cinco mililitros para un total de nueve controles de compensación, dos tipos de cuentas sin mancha más siete fluorocromos diferentes del panel marcador. Para optimizar los controles de compensación de fluorescencia, agregue una gota de perlas de compensación del vial de compresión a cada tubo. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpo a las cuentas.
Repita el proceso para cada anticuerpo desde el panel de marcadores. Utilice los controles FMO para optimizar la tinción de fondo debido a la superposición espectral. A las células de los tubos de control FMO, agregue todos los anticuerpos del panel marcador en una dilución de uno a 100, pero excluya un anticuerpo.
Repita el proceso para cada anticuerpo para un total de siete controles. Utilice anticuerpos de control que coincidan con isotipos para la tinción no específica. A las células de los tubos etiquetados con isotipo, agregue el anticuerpo de control que coincida con el isotipo en una dilución de uno a 100.
A continuación, prepare las celdas que se van a ordenar. A las células recién aisladas, agregue un cóctel de anticuerpos en una dilución de uno a 100. Además, agregue el tinte de viabilidad celular en una dilución de uno a 1.000.
Mezcle vigorosamente los controles de compensación por vórtice de pulso. Incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz, excepto por las perlas de viabilidad celular, que se pueden dejar a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Mezclar suavemente los controles FMO, los controles emparejados con isotipos y las celdas que se ordenarán por vórtice de pulso.
Incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz. Agregue tres mililitros de búfer de tinción FACS a cada control de compensación, control FMO y control de isotipo. Centrifugar los tubos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar la solución y resuspender cada pellet en 400 microlitros de tampón de tinción FACS. Los controles de compensación, los controles FMO y los controles de isotipo ya están listos para usarse. Después de la tinción, lave las células con tampón de tinción FACS por centrifugación a 300 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar la solución y resuspender el pellet celular en el tampón de tinción FACS a 0,5 millones de células por mililitro. Usando nuevos tubos FACS que tienen tapas de filtro de 35 micras, pipetee las muestras de celda manchadas en las tapas y el filtrado por gravedad para obtener suspensiones de una sola célula. Manténgase en hielo.
Utilice un clasificador de celdas para purificar las celdas. Ejecute las celdas no manchadas en el clasificador de celdas para ajustar los voltajes y corregir la señal de fondo. Ejecute cada muestra de cordón de compensación de un solo color de una en una para ajustar los voltajes para cada canal y ajustar las puertas para la señal positiva.
Recopile los datos. Utilice el software para calcular la superposición espectral calculando la matriz de compensación. Todos los voltajes están listos y configurados.
Ejecute cada control de isotipo de uno en uno. Estos datos se pueden utilizar para ajustar las puertas para el enlace no específico si los hay. Ejecute cada muestra FMO una a la vez.
Ajuste los voltajes de cada canal para corregir el sangrado espectral debido a un panel multicolor. Ejecute las muestras de celda manchadas en el clasificador de celdas. Recoger células en medios de cultivo libres de enzimas de 10 mililitros en un tubo de recolección cónica de 15 mililitros.
Utilice la siguiente estrategia de medición. Primero, puerta para celdas individuales. Entonces, puerta para celdas vivas.
A continuación, puerta para células CD45 negativas. Puerta para células CD34 y CD31-negativas. Entonces, puerta para las células NG2-positivas.
Y por último, puerta para células CD146 y CD140b-positivas. Para cultivar pericitos, siembra las células recién obtenidas en medios de cultivo libres de enzimas en una placa recubierta de 24 pozos. Cultivo de las células en una incubadora celular establecido en 37 grados Celsius, 5%dióxido de carbono, y 95%oxígeno.
Después de la digestión enzimática y la disociación de todo el corazón y antes de la purificación FACS de las células, las células son una mezcla bruta que contiene muchos tipos de células diferentes del corazón. Después de la purificación y el cultivo de FACS, las células son homogéneas. Son nucleados, bastante planos, y tienen la morfología típica de los rodboides pericitos.
Usando FACS, las células se purifican a homogeneiza. En primer lugar, los escombros y los dobletes fueron cerrados en función de las distribuciones de dispersión hacia adelante y laterales. Luego, las células muertas fueron cerradas debido a su reacción de amina con el tinte, que produce una señal mayor e intensa que las células vivas.
De las células vivas, las células hematopoyéticas fueron cerradas por ser CD45-positivas. Para eliminar aún más las células hematopoyéticas y endoteliales, se han cerrado las células CD34 positivas y CD31 positivas. Finalmente, se seleccionaron células NG2-positivas y CD140b/CD146-positivas por ser células perivasculares con expresión de marcadores de pericitos típicos.
En comparación con los pericitos cerebrales humanos, las células tenían una morfología similar. En comparación con las células musculares lisas humanas y de ratón, las células tenían una morfología diferente Caracterización fenotípica de las células en el paso siete por inmunocitoquímica para marcadores de pericitote no mostraron cambios observados en la morfología o expresión de marcadores. Del mismo modo, el análisis por citometría de flujo de los pericitos en el paso siete confirmó que la población seguía siendo homogénea.
La viabilidad celular es fundamental para obtener un buen rendimiento. Mantenga el tejido frío durante el aprovisionamiento y mantenga las células frías durante la tinción celular. Además, asegúrese de que la solución enzimática se prepara fresca cada vez.
Para asegurar el aislamiento de las células correctas después del cultivo, dicterílas con citometría de flujo y tinción inmunofluorescente. Estas células se pueden utilizar en experimentos de cocultura con células endoteliales para estudios de barreras funcionales, así como ensayos para estudiar su función y características biológicas y fisiológicas. Los pericitos cardíacos desempeñan un papel fundamental en la integridad vascular y la estabilidad, y su disfunción es consecuente a la función cardíaca global.
Con nuestra técnica, los investigadores pueden explorar el potencial terapéutico de los pericitos cardíacos.
