Para comenzar, monte un portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de baño experimental. Cubra el portaobjetos con dos o tres microlitros de laminina y déjelo secar durante 30 segundos. Luego, vierta aproximadamente 400 microlitros de la suspensión de fibra muscular en el portaobjetos y deje que las fibras se adhieran a la laminina durante 10 a 15 minutos.
Coloque la cámara experimental en la platina de un microscopio invertido equipado para la epifluorescencia. Para verificar la viabilidad de las fibras, coloque dos electrodos de platino a cada lado de la cámara experimental. Después de aplicar pulsos de corriente rectangulares durante 0,8 a 1,2 milisegundos, observe las contracciones de las fibras musculares en los extremos.
Cargue las fibras con 3,5 a 4,5 micromolares del colorante de calcio rápido Mag-Fluo-4 AM durante cuatro o cinco minutos en una solución de Tyrode. Después de lavar el portaobjetos con la solución de Tyrode, deje que el tinte intracelular se desesterifique durante 15 a 20 minutos en la oscuridad. Durante la adquisición de transitorios de calcio bajo iluminación atenuada, recoja y guarde las señales luminosas con un objetivo de inmersión en aceite 40X y un tubo fotomultiplicador conectado a un digitalizador.
En el software de adquisición, asegúrese de tener una escala de cero a 200 unidades arbitrarias. A continuación, ajuste el tamaño del punto de excitación y la ganancia del tubo fotomultiplicador para establecer la fluorescencia en reposo, o F-rest, en 10 unidades arbitrarias. Para analizar las grabaciones, establezca un filtro de paso bajo en todo el trazado a un kilohercio.
A continuación, ajuste el pico para calcular el silencio F en un segundo de la traza. Ajuste el reposo F a cero y mida la amplitud del transitorio máximo de calcio sarcoplásmico. Mida el tiempo de subida del 10% al 90% de la amplitud, la duración a la mitad del máximo y el tiempo de decaimiento del 90% al 10% de la amplitud.
Luego, estime la cinética de decaimiento de acuerdo con un ajuste con la función biexponencial. Calcula la concentración máxima de calcio en micromolares. Por último, guarde los valores de las constantes de tiempo de decaimiento tau 1 y tau 2, y las amplitudes A1 y A2. Los músculos FDB y EDL mostraron una cinética de calcio conocida como morfología tipo II, los músculos sóleo mostraron morfología de los transitorios de calcio tipo I.
Las fibras de los músculos PDQA, PL y EHL compartían la morfología tipo II. Las señales cinéticas transitorias de calcio de PDQA, PL y EHL fueron similares a las señales de los músculos FDB EDL, pero difirieron de las señales del músculo sóleo.
