Para empezar, utilice los cebadores específicos 515f y 806r para amplificar la región hipervariable V4 del gen 16S rNA. Realice la PCR utilizando las condiciones dadas. A continuación, agregue 3,5 microlitros de tampón de secuenciación y 1,5 microlitros de mezcla de enzimas al tubo.
Después de mezclar y girar la muestra, configure una reacción de termociclador. Ahora, agregue la mezcla de ligadura del adaptador en el tubo e incube a 20 grados centígrados durante 15 minutos en un termociclador. Agregue 1,5 microlitros de enzima reactiva de extensión específica de uracilo a la mezcla de ligadura e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Ahora, agregue 43.5 microlitros de perlas magnéticas al ADN de ligadura adaptador y mezcle 20 veces. Después de cinco minutos, coloque el tubo en una rejilla magnética durante cinco a 10 minutos para separar las perlas y deseche el sobrenadante. Lavar el pellet con 100 microlitros de etanol al 80% y secar las perlas durante 30 segundos.
Para eluir las perlas en gránulos, agregue 8,5 microlitros de Tris HCl de 10 milimolares en el tubo e incube durante dos minutos. Coloque el tubo en una rejilla magnética y extraiga 7,5 microlitros de ADN eludido como sobrenadante en un nuevo tubo. Agregue reactivos de PCR al tubo adaptador que contiene ADN ligado para configurar una reacción de 25 microlitros.
Para limpiar el ADN amplificado, agregue 22,5 microlitros de perlas magnéticas en el tubo y mezcle 20 veces. Después de cinco minutos, retire 50 microlitros de sobrenadante y lave las perlas con 100 microlitros de etanol al 80%. Vuelva a suspender las perlas de color marrón oscuro en 16 microlitros de agua y mezcle 20 veces.
Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 30 a 60 segundos y transfiera 15 microlitros a un tubo nuevo. Mezcle 90 microlitros de tampón, un microlitro de tinte y dos microlitros de muestra de biblioteca de ADN y lea la concentración de ADN en un fluorímetro. Después de diluir el ADN en dos nanomolares, cargue de 27 a 30 microlitros de la celda de flujo y colóquela en el secuenciador.
Guarde los archivos FASTQ obtenidos del secuenciador. Haga clic para abrir un archivo de hoja de cálculo y crear un archivo de asignación o metadatos. Abra el sitio web de Nephele, cargue los archivos FASTQ y lea QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
A continuación, con DADA2, ejecute lecturas de extremos emparejados demultiplexados, sustitución de filtros, errores de quimera y fusión. Utilice el clasificador Bayes ingenuo entrenado en la unidad taxonómica operativa Silva versión 132 99%, o base de datos OTU, para realizar la asignación taxonómica bacteriana con una similitud del 97%. Abra el sitio web de MicrobiomeDB.
Haga clic para cargar los archivos y generar las curvas de diversidad alfa, diversidad beta, abundancia relativa y rarefacción de OTU. Finalmente, abra una hoja de cálculo y transfiera datos para hacer mapas de calor, diagramas de Venn y tamaño de efecto de análisis discriminante lineal. Un mapa de calor basado en la abundancia relativa de bacterias en diferentes etapas de la vinificación mostró el dominio de filos como Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota y Fusobacteriota.
A nivel de género, se identificaron géneros importantes como Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae. Un análisis del diagrama de Venn reveló 15 OTU únicas compartidas desde el mosto de uva hasta el vino final. Los resultados de la secuenciación del amplicón basada en la región variable V4 también indicaron la diversidad alfa en las dos traminetas R y L. El análisis de la diversidad beta mostró un cambio en las bacterias durante la fermentación, pero la composición bacteriana en el vino final fue similar a la de las etapas de mosto y levadura añadida.
