El objetivo general del experimento fue identificar fragmentos de ADN afiliados a proteínas en todo el genoma, lo que reflejaba el estado de la cromatina. Para lograr este objetivo, se realizaron tres operaciones especiales. En primer lugar, se aislaron los núcleos intactos de las células vegetales.
En segundo lugar, las modificaciones en la cromatina fueron reconocidas por un anticuerpo específico in situ. En tercer lugar, el anticuerpo que une una proteína de fusión de la proteína A-transposasa, la transposasa Tn5, escinde la cromatina in situ bajo la activación de iones de magnesio. Los fragmentos de ADN y los sitios de unión a la modificación de la cromatina se integraron con adaptadores y se prepararon para la preparación del ADN.
El enriquecimiento por reacción en cadena de la polimerasa mejoró la secuenciación de la generación. La regulación epigenómica a nivel cromático, incluidas las modificaciones del ADN y las histonas, los comportamientos de los factores de transcripción y los ARN no codificantes con sus proteínas reclutadas, conducen al control temporal y espacial de la expresión génica. La tecnología CUT&Tag desarrollada por Henikoff Lab es un método de anclaje enzimático para el perfil de epigenómica de cromatina con una alta eficiencia.
Aquí empleamos las hojas de algodón como materiales experimentales, y para realizar el perfil de cromatina utilizando el anticuerpo de histona H3 lisina-4 trimetilación como ejemplo. Proporcionamos un protocolo refinado con video para el rendimiento de CUT&Tag en plantas. Para cada preparación de la muestra utilizando CUT&Tag, se recogió un gramo de tejido de hoja de algodón.
La hoja se molía en un polvo fino con nitrógeno líquido y se transfería a un tubo de halcón de 50 ml que contenía 25 ml de tampón de aislamiento nuclear refrigerado A.La solución tampón se mezcló suavemente y el tubo se incubó en hielo durante cinco minutos con una agitación suave para dispersar el material de manera uniforme. Luego se hizo girar a 500 fuerza centrífuga relativa o rcf, a 4 grados Centígrados, durante cinco minutos, para formar el gránulo celular. El sobrenadante se decantó y el pellet se resuspendió con 20 ml de tampón B de aislamiento nuclear refrigerado, complementado con 0,5% tritón.
El tubo se invirtió suavemente para resuspendir el pellet por completo. El lisado celular resultante se filtró con una combinación de dos tamices, se utilizó un tamiz de 500 mallas en la parte superior para eliminar los restos de tejido más grandes. Y se utilizó un tamiz de 1000 mallas en la parte inferior para recoger los núcleos.
La elección del tamaño de malla apropiado de los tamices depende del tamaño de los núcleos de las plantas. Se utilizó papel de filtro estéril en la parte posterior del tamiz para absorber parte del lisado y los desechos de células pequeñas. El lisado que contenía los núcleos se transfirió a un tubo de centrífuga fresco de 1,5 mililitros, y giró a 300 rcf durante cuatro minutos, a 4 grados Celsius grados Celsius para recoger los núcleos.
Después de la centrifugación, se utilizó una punta de pipeta para eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante. Se agregó una cantidad de 800 microlitros, un amortiguador de lavado nuclear. Y el tubo se invirtió suavemente para resuspendir los núcleos.
El tubo se giró de nuevo a 300 rcf, durante cuatro minutos a 4 grados centígrados. Después de un total de tres lavados, los núcleos resultantes se combinaron en un tubo de centrífuga fresco de 1,5 mililitros, y giraron a 300 rcf, durante cuatro minutos a 4 grados centígrados. Se utilizó una punta de pipeta para eliminar la mayor cantidad posible del búfer restante.
El siguiente paso fue la incubación del anticuerpo. Una alícuota de 50 microlitros de núcleos fue resuspendida en 1 mililitro de tampón de anticuerpos suplementado con EDTA, BSA, cóctel inhibidor de la proteasa en digitonina. Se colocó una alícuota de 150 microlitros de la suspensión de núcleos en un tubo fresco de 1,5 mililitros para una reacción, se agregaron dos microlitros de anticuerpos a cada tubo.
En este ensayo, se establecieron dos réplicas biológicas para los grupos de control anti-histona-H3-lisina-4-trimetilación e inmunoglobulina G negativa después de agregar el anticuerpo. La solución se mezcló suavemente y los tubos se dejaron en un agitador horizontal para su hibridación durante la noche a cuatro grados centígrados a 12 rpm. A la mañana siguiente, se sacaron los tubos y se lavaron los núcleos con 800 microlitros de tampón de lavado de inmunoprecipitación.
El tubo se invirtió suavemente para mezclarlo y se dejó en un agitador horizontal durante cinco minutos a temperatura ambiente a 12 rpm. Después del lavado, el tubo se giró a 300 rcf durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró con una punta de pipeta.
Esto se repitió durante un total de tres lavados. Después del tercer lavado, el tubo se hizo girar un 300 rcf durante dos minutos a cuatro grados centígrados, y se utilizó una punta de pipeta para eliminar el tampón restante tanto como fuera posible. Preparar la mezcla de transposasa Tn5 para la incubación.
Se agregó un microlitro de transposasa a cada 150 microlitros del tampón de incubación de transposasa. Recomendamos preparar primero la mezcla de solución de transposasa de acuerdo con el número de reacciones. Y luego agregando una alícuota de 150 microlitros a cada tubo.
La solución se mezcló suavemente y se dejó en un agitador horizontal a temperatura ambiente a 12 rpm durante dos horas. Los tubos se mezclaron suavemente cada 10 a 15 minutos. Después de la incubación, los núcleos se lavaron tres veces utilizando 800 microlitros de tampón de lavado de inmunoprecipitación a temperatura ambiente para eliminar la transposasa Tn5 no unida.
Después del tercer lavado, el tubo se giró a 300 rcf durante dos minutos a cuatro grados centígrados, y se utilizó una punta de pipeta para eliminar el tampón restante. Para el paso de etiquetado, se agregaron 300 microlitros de tampón de tagmentación al tubo de reacción. La solución se mezcló bien y se incubó a 37 grados centígrados durante una hora.
Después de la incubación se agregaron 10 microlitros de 0,5 mole por litro de EDTA a 30 microlitros de 10% SDS para determinar la reacción. A continuación se añadieron 300 microlitros de tampón de extracción de ADN. Se realizó extracción irregular de ADN.
Los fragmentos de ADN se disolvieron en 25 microlitros de agua estéril. Se utilizaron 24 microlitros para la amplificación por PCR en la construcción de la biblioteca NGS. Esta figura muestra la tinción de núcleos intactos con DAPI en imágenes, bajo un microscopio obtener una cantidad adecuada de núcleos intactos y relativamente limpios es el paso crítico para CUT&Tag.
Después de la PCR, se transfirieron dos microlitros y se verificó el tamaño del ADN en gel de agarosa al 1,5%. Esta figura muestra que se comparan con el gen de la inmunoglobulina el control negativo. La mayor parte de los fragmentos de ADN de la muestra de trimetilación de histona H3 lisina 4 debe oscilar entre 280 y 500 pares de bases.
Los fragmentos de ADN pueden ser purificados y luego perfilados por secuenciación de alto rendimiento. Esta figura muestra los resultados de la secuenciación de generación para el anticuerpo anti-histona H3 Lisina 4 Trimetilación en comparación con los grupos de control de inmunoglobulina G negativa. Esta tecnología genera las bibliotecas de ADN a alta resolución y un fondo excepcionalmente bajo utilizando un pequeño número de células con un procedimiento simplificado en comparación con ChIP-seq.
CUT&Tag es un método nuevo y aún en progreso.
