Para empezar, corta el papel de filtro en forma rectangular de aproximadamente 17 por 20 milímetros y retira las cuatro esquinas. Luego, crea aproximadamente siete por 10 milímetros de centro hueco en el papel de filtro. Coloque un anillo disponible en el mercado a una capa de película flexible y cree un centro hueco en la capa de película flexible.
Coloque un anillo preparado en una placa de Petri de 35 milímetros. Después del precultivo, recupere el huevo de la incubadora y colóquelo en su eje largo en la bandeja del cartón de huevos. Limpie toda la superficie de la cáscara de huevo con etanol al 70% y déjela reposar durante 15 minutos.
Sostén el huevo en su eje corto y rómpelo por la parte inferior. Abre el huevo sobre una placa de Petri limpia de 100 milímetros para extraer su contenido. Con una pipeta, transfiera aproximadamente 10 mililitros de la albúmina delgada a un tubo de 15 mililitros para el cultivo ex ovo.
Llene el pozo central de la placa de cultivo con albúmina fina. Con papel de seda, retire suavemente la albúmina gruesa adherida a la membrana vitelina del embrión. Ahora, adhiera con cuidado el papel de filtro a la membrana vitelina, asegurándose de que el eje del cuerpo del embrión se alinee con el rectángulo central del papel de filtro.
Corta la membrana que rodea el papel de filtro con unas tijeras. Con unas pinzas, tire suavemente del papel de filtro aislado para separarlo del yugo en dirección oblicua. Dale la vuelta al papel de filtro para colocar el embrión con la parte dorsal hacia abajo.
Sumerja con cuidado todo el papel de filtro de un lado del eje largo en la placa de Petri de 100 milímetros que contiene el medio de lavado. Con una pipeta limpia, rocíe suavemente el medio de lavado paralelo al papel de filtro para eliminar cualquier resto de yema. A continuación, retira con cuidado el papel de filtro del medio de lavado y utiliza papel de seda para absorber el exceso de medio de los bordes del embrión.
Coloque el papel de filtro con el embrión en la placa de cultivo, asegurándose de que el lado dorsal del embrión esté hacia abajo. Transfiera la placa de cultivo a la incubadora en el escenario para el cultivo ex ovo. Llene los platos de cultivo con un medio de lavado tibio.
Cuando el embrión alcance una etapa de desarrollo deseada, transfiera el papel de filtro con el embrión a la placa de cultivo llena de un medio de lavado. Coloque la placa de cultivo en la incubadora del escenario del microscopio Brillouin. Para el proceso de calibración, mida la señal de Brillouin del agua.
A continuación, mida la señal de Brillouin del metanol. En imágenes de campo claro con una lente de objetivo de cuatro aumentos, ajuste el punto de iluminación láser al segundo par de somitas. Luego, cambie a una lente de objetivo de 40 veces y realice un ajuste fino del punto láser en el centro del tubo neural.
Desbloquee el rayo láser y ajuste el plano focal. Escanee el embrión utilizando una etapa de traslación bidimensional y adquiera una imagen de Brillouin de la región de interés. Después de completar la exploración, retire con cuidado el papel de filtro con el embrión.
Use papel de seda para absorber el exceso de medio de lavado del embrión. Vuelva a colocar el embrión en la placa de cultivo llena de albúmina delgada para un cultivo continuo. Para la reconstrucción de imágenes de Brillouin, cargue los datos de la señal de agua y metanol.
Haga clic en establecer región y seleccione la región con cuatro puntos para calcular los parámetros de calibración. Guarde los resultados de la calibración. Cargue los datos de escaneo de embriones y haga clic en iniciar para el procesamiento de los parámetros.
Por último, reconstruya la imagen 2D de Brillouin basándose en los desplazamientos de Brillouin de todos los píxeles. El desplazamiento de Brillouin en el módulo longitudinal estimado de la placa neural frente al número de somitas y el tiempo de incubación mostró un aumento en el desplazamiento de Brillouin del tejido durante el cierre del tubo neural.
