Para comenzar, aspire los medios de los pocillos donde se cultivan las células encapsuladas en hidrogel en la placa de 24 pocillos. Enjuague los hidrogeles pipeteando 500 microlitros de PBS directamente en cada pocillo que contenga los hidrogeles y luego aspire suavemente el PBS. Con una pipeta de 1.000 microlitros, añada 500 microlitros de solución fijadora por pocillo para fijar los esferoides en la placa de 24 pocillos.
Deje que el fijador remoje los geles durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes de pipetear la solución fijadora y desecharla en un contenedor de residuos designado. A continuación, enjuague los hidrogeles con PBS tres veces como se demostró anteriormente. Si no se usan inmediatamente, almacene los hidrogeles en 500 microlitros de PBS por pocillo a cuatro grados centígrados hasta por una semana.
Para teñir las células encapsuladas en hidrogel, primero prepare anticuerpos primarios adecuadamente diluidos para la nestina y SOX2. Después de aspirar el PBS de los pocillos, agregue 50 microlitros de los anticuerpos diluidos a cada pocillo. Incubar las células con los anticuerpos durante 24 horas para teñirlas por completo.
A continuación, con una pipeta de 1.000 microlitros, retire la solución de tinción y deseche los residuos de forma adecuada. Después de enjuagar los hidrogeles tres veces, guárdelos en PBS a cuatro grados centígrados hasta dos semanas antes de la obtención de imágenes, o tome imágenes inmediatamente. Para eliminar el esferoide teñido y mejorar la transparencia de las imágenes, primero aspire el PBS de cada pocillo.
A continuación, trate secuencialmente los esferoides con 500 microlitros de formamida al 20%, 40% y 80% por pocillo durante 90 minutos cada uno. Finalmente, incubar los hidrogeles en formamida al 100% durante 24 horas antes de la toma de imágenes. Los esferoides se obtuvieron imágenes a diferentes profundidades de la pila z, lo que permitió la evaluación de la viabilidad de la celda en cada ubicación dentro de la pila z.
Una proyección máxima utilizando la pila de esferoides representaba el punto más alto de intensidad de luz dentro de cada ubicación, simplificado en una sola imagen. Las imágenes representativas de los esferoides teñidos revelaron que el factor de transcripción de autorrenovación, SOX2, estaba colocalizado con DAPI en el núcleo. Por el contrario, el marcador de células madre nestina estaba presente en todas las células.
No hubo diferencia entre el esferoide de flotación libre sin gel y los esferoides encapsulados, posiblemente debido a la inercia del gel PEG utilizado. Las imágenes representativas de secciones ópticas a unas 90 micras en esferoides aclarados y no aclarados revelaron que cuando se realizaba el aclarado, el núcleo del esferoide podía obtener imágenes a unas 30 micras más profundas en comparación con un esferoide no aclarado.
