이 연구는 세인트루이스 대학교가 실비야 P 주스티악 박사에게 제공한 창업 자금과 세인트루이스 대학교의 헨리 앤 아멜리아 나스랄라 신경과학 센터(Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience)가 실비야 P 주스티악 박사에게 수여한 시드 그랜트로 자금을 지원받았습니다.

PEG 하이드로겔에서 종양 스페로이드의 3D 캡슐화 후

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+formation+on+non-adhesive+surfaces+by+liquid+overlay+technique:+Considerations+and+practical+approaches.">Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).</li><li>Li, Y., Kumacheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microenvironments+for+cancer+spheroid+growth+and+drug+screening.">Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening.</a> Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).</li><li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids.">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506 (2020).</li><li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels.">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li><li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors.">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma.">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li><li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens.">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371 (2019).</li><li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids.">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li><li>Chen, J. -. W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model.">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).</li><li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. 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K., Hauser, H., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. 140, (2007).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery.">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).</li><li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening.">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li><li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure.">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).</li><li>Alifieris, C., Trafalis, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-hydrogel+interactions+in+tissue+engineering:+Mechanisms+and+applications.">Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).</li><li>Kroger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+hydrolytically+degradable+polyethylene+glycol+crosslinkers+for+facile+control+of+hydrogel+degradation.">Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation.</a> Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).</li><li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecularly+engineered+PEG+hydrogels:+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration.">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li><li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels.">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shooting+for+the+moon:+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics.">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li><li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying.">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li><li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity.">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).</li><li>Lee, K. -. H., Kim, T. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening.">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445 (2021).</li></ol>

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하이드로겔 기반 다세포 종양 스페로이드 모델은 암 치료 발견을 발전시키기 위해 점점 더 많이 개발되고 있습니다 11,13,29. 이 모델은 통제된 방식으로 종양 미세환경의 주요 파라미터를 모방하고, 복잡성에도 불구하고 in vivo 모델보다 사용이 간단하고 저렴하며, 많은 모델이 고처리량 스크리닝 기술과 호환되기 때문에 유용?...

종양 스페로이드는 암 병인학, 병리학 및 약물 반응성을 연구하는 데 유용한 시험관 내 도구로 부상했습니다1. 전통적으로 스페로이드는 저접착 플레이트 또는 바이오리액터와 같은 조건에서 배양되어 왔으며, 세포 표면 접착보다 세포간 접착이 선호됩니다2. 그러나 이제 종양 미세환경을 보다 충실하게 재현하기 위해 시험관 내 스페로이드 모델은 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 모두 캡처해야 한다는 것이 인식되었습니다. 이로 인해 여러 그룹이 스페로이드를 캡슐화할 수 있는 하이드로겔과 같은 스캐폴드를 설계하게 되었습니다 3,4. 이러한 하이드로겔 기반 스페로이드 모델은 생존율, 증식, 줄기성 또는 치료 반응성과 같은 다양한 세포 거동에 대한 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 규명할 수 있습니다3.
여기서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔에서 교모세포종 스페로이드를 캡슐화하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 하이드로겔의 교모세포종 세포 스페로이드 캡슐화에 대한 여러 문헌 보고가 있습니다. 예를 들어, RGDS 접착 리간드로 장식된 PEG 하이드로겔에 U87 세포를 캡슐화하고 효소로 절단할 수 있는 펩타이드로 가교하여 세포 거동에 대한 하이드로겔 강성의 효과를 측정함으로써 스페로이드를 형성했습니다5. U87 세포는 암 줄기세포 집단을 확장하기 위해 다른 PEG 기반 또는 히알루론산 기반 하이드로겔에서도 형성되었으며,6 화학요법 내성의 매트릭스 매개 메커니즘을 탐색하기 위해형성되었습니다 7,8,9. 교모세포종 스페로이드는 또한 미세아교세포와 암세포 사이의 누화와 세포 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 젤라틴 하이드로겔에 캡슐화되었습니다10. 전반적으로, 이러한 연구는 교모세포종 병리를 이해하고 치료법을 고안하는 데 하이드로겔 기반 시험관 내 모델의 유용성을 입증했습니다.
또한, 종양 스페로이드 제조 및 하이드로겔 캡슐화를 위한 다양한 방법이 있다11. 예를 들어, 분산된 세포는 하이드로겔에 파종될 수 있고 시간이 지남에 따라 스페로이드를 형성할 수 있습니다 5,12. 이러한 방법의 한 가지 단점은 형성된 스페로이드의 다분산성으로, 이는 세포 반응 차이를 유발할 수 있습니다. 균일한 스페로이드를 생산하기 위해, 세포를 마이크로겔에 캡슐화하고 겔13에 침입하여 리모델링할 때까지 장기간 배양하거나, 세포를 구형 '구멍'이 있는 템플릿 겔에 증착하고 응집시키도록 허용할 수 있다14. 이러한 방법의 단점은 상대적인 복잡성, 마이크로겔 또는 겔의 '구멍'을 형성하기 위한 액적 발생기 또는 기타 수단의 필요성, 스페로이드가 성장하고 성숙하는 데 걸리는 시간입니다. 대안적으로, 스페로이드는 마이크로웰(9,15,16) 또는 행잉-드롭 플레이트(17,18)에서 예비-형성될 수 있고, 이어서 여기에 설명된 기술과 유사하게 하이드로겔에 캡슐화될 수 있다. 이러한 방법은 더 간단하며 더 높은 처리량 방식으로 수행할 수 있습니다. 흥미롭게도, 스페로이드 형성 방법은 유전자 발현, 세포 증식 또는 약물 반응성과 같은 스페로이드 세포 거동에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다19,20.
여기서 우리는 교모세포종에 초점을 맞추는데, 교모세포종은 부드러운 나노다공성 하이드로겔로 모방할 수 있는 부드러운 나노다공성 뇌 기질21을 본래 환경에 있는 고형 종양이기 때문입니다. 교모세포종은 또한 치료법이 없는 가장 치명적인 뇌종양이다22. 그러나, 여기에 기술된 프로토콜은 임의의 고형 종양을 나타내는 스페로이드의 캡슐화에 사용될 수 있다. 우리는 마이클 형 첨가 반응23을 통해 형성되는 PEG 하이드로 겔을 사용하기로 결정했습니다. PEG는 불활성이고 스캐폴딩 및 물리적 세포 지지체 역할을 하지만 세포 부착을 지지하지 않는 합성, 비분해성 및 생체 적합성 하이드로겔입니다(23). 세포 접착성은 전체 단백질 또는 접착 리간드(24)의 테더링을 통해 별도로 첨가될 수 있고, 분해성은 PEG 중합체 사슬 또는 가수분해 또는 효소적으로 분해되는 가교결합제(25,26)의 화학적 변형을 통해 첨가될 수 있다. 이를 통해 기계적 또는 물리적 하이드로겔 특성과 독립적으로 생화학적 특성을 조정할 수 있으며, 이는 세포-매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 유리할 수 있습니다. 마이클 유형 겔화 화학은 선택적이며 생리적 조건에서 발생합니다. 따라서 스페로이드를 하이드로겔 전구체 용액과 혼합하기만 하면 스페로이드 캡슐화가 가능합니다.
전반적으로 여기에 제시된 방법론에는 몇 가지 주목할 만한 특징이 있습니다. 첫째, 멀티웰 어셈블리에서 종양 스페로이드를 제조하는 것이 효율적이고 빠르며 필요한 재료의 비용이 저렴합니다. 둘째, 스페로이드는 다분산성이 낮은 다양한 크기의 대량 생산됩니다. 마지막으로, 상업적으로 이용 가능한 재료만 필요합니다. 이 방법론의 유용성은 스페로이드 세포 생존율, 순환성 및 세포 줄기에 대한 기질 특성의 효과를 탐구함으로써 설명됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>LC22210-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conicals</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate Ultra Low Attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>706011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conicals</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>3181345107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well AggreWell 400&#160;</td>
			<td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>34421</td>
			<td>Square pyramidal microwells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>Cat #: 07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide</td>
			<td>Genic Bio, Shanghai, China</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical Fume Hood</td>
			<td>KEWAUNEE</td>
			<td>99151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent - Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30073-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Slumpys</td>
			<td>GBS4100SFSL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>5 3/4&#34;: 1367820A, 9&#34;:136786B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide</td>
			<td>Genic Bio, Shanghai, China</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>383684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic solution - Repel Silane&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-8500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope (Axiovert 25)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>663526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3&#39;-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>D1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal SP8</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>3820005619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2 mL: 02681258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision Rel. 4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PARAFILM&#160;</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x), pH 7.4</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>1670046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>P-76864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1&#8211;200 &#181;L, 101&#8211;1000 &#181;L)</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>2707509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Weigh Boats (100 mL)</td>
			<td>Amazon&#160;</td>
			<td>mdo-azoc-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>SH-PEG-SH-3400-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td>
			<td>Elsworth Adhesives</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Examination Gloves</td>
			<td>Quest</td>
			<td>92897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AAJ66584AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>JTR-S-0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-365823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine, &#8805;99.0% (GC)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG human glioblastoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection&#160;</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor spheroid fabrication and encapsulation in polyethylene glycol hydrogels for studying spheroid-matrix interactions

스페로이드의 3차원(3D) 캡슐화는 최적의 세포 성장을 위해 종양 미세환경을 적절하게 복제하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 종양 세포외 미세환경을 모방하기 위해 스페로이드 캡슐화를 위한 시험관 내 3D 교모세포종 모델을 설계했습니다. 먼저, 폴리디메틸실록산을 사용하여 정사각형 피라미드형 마이크로웰 몰드를 형성했습니다. 그런 다음 이 마이크로웰 몰드를 사용하여 50-500μm의 엄격하게 제어된 크기의 종양 스페로이드를 제작했습니다. 스페로이드가 형성되면 수거하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 하이드로겔에 캡슐화했습니다. PEG 하이드로겔은 스페로이드 캡슐화를 위한 다목적 플랫폼으로, 강성, 분해성 및 세포 접착성과 같은 하이드로겔 특성을 독립적으로 조정할 수 있습니다. 여기서는 대표적인 연화(~8kPa) 하이드로겔을 사용하여 교모세포종 스페로이드를 캡슐화했습니다. 마지막으로, 스페로이드를 염색하고 이미지화하는 방법이 개발되어 컨포칼 현미경을 통해 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 조밀한 스페로이드 코어와 상대적으로 희박한 주변부로 인해 이미징이 어려울 수 있지만 투명화 용액과 공초점 광학 절편을 사용하면 이러한 이미징 어려움을 완화하는 데 도움이 됩니다. 요약하면, 균일한 스페로이드를 제조하고, PEG 하이드로겔에 캡슐화하고, 캡슐화된 스페로이드에 대해 공초점 현미경을 수행하여 스페로이드 성장 및 다양한 세포-기질 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다.

Tumor spheroids have emerged as useful in vitro tools in studying cancer etiology, pathology, and drug responsiveness1. Traditionally, spheroids have been cultured in conditions such as low adhesion plates or bioreactors, where cell-cell adhesion is favored over cell-surface adhesion2. However, it is now recognized that to recapitulate the tumor microenvironment more faithfully, in vitro spheroid models should capture both cell-cell and cell-matrix interactions. This has prompted multiple groups to design scaffolds, such as hydrogels, where spheroids can be encapsulated3,4. Such hydrogel-based spheroid models enable the elucidation of cell-cell and cell-matrix interactions on various cell behaviors, such as viability, proliferation, stemness, or therapy responsiveness3.
Here, we describe a protocol for the encapsulation of glioblastoma spheroids in polyethylene glycol (PEG) hydrogels. There are multiple literature reports of glioblastoma cell spheroid encapsulation in hydrogels. For example, spheroids were formed by encapsulating U87 cells in PEG hydrogels decorated with an RGDS adhesive ligand and crosslinked with an enzymatically cleavable peptide to determine the effect of hydrogel stiffness on cell behavior5. U87 cells have also been formed in other PEG-based or hyaluronic acid-based hydrogels to expand the cancer stem cell population6 or to explore matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance7,8,9. Glioblastoma spheroids have also been encapsulated in gelatin hydrogels to study the crosstalk between microglia and cancer cells and its effect on cell invasion10. Overall, such studies have demonstrated the utility of hydrogel-based in vitro models in understanding glioblastoma pathology and devising treatments.
Further, there are different methods for tumor spheroid fabrication and hydrogel encapsulation11. For example, dispersed cells could be seeded in hydrogels and allowed to form spheroids over time5,12. One drawback of such a method is the polydispersity of the formed spheroids, which could lead to differential cell responses. To produce uniform spheroids, cells could be encapsulated in microgels and cultured for extended periods until they invade and remodel the gel13, or cells could be deposited in templated gels with spherical &#39;holes&#39; and allowed to aggregate14. The drawback of these methods is their relative complexity, the need for a droplet generator or other means to form microgels or the &#39;holes&#39; in the gel, and the time it takes for spheroids to grow and mature. Alternatively, spheroids could be pre-formed in microwells9,15,16 or in hanging-drop plates17,18 and then encapsulated in a hydrogel, similar to the technique described here. These methods are simpler and can be done in a higher throughput fashion. Interestingly, it has been shown that the method of spheroid formation can affect spheroid cell behaviors, such as gene expression, cell proliferation, or drug responsiveness19,20.
Here, we focus on glioblastoma since it is a solid tumor whose native environment is the soft, nanoporous brain matrix21, which can be mimicked by a soft, nanoporous hydrogel. Glioblastoma is also the deadliest brain cancer for which there is no available cure22. However, the protocol described here can be used for the encapsulation of spheroids representing any solid tumor. We chose to use PEG hydrogels that are formed through a Michael-type addition reaction23. PEG is a synthetic, non-degradable, and biocompatible hydrogel that is inert and serves as scaffolding and physical cell support but does not support cell attachment23. Cell adhesiveness can be added separately via tethering of whole proteins or adhesive ligands24, and degradability can be added via chemical modifications of the PEG polymer chain or hydrolytically or enzymatically degradable crosslinkers25,26. This allows for biochemical properties to be tuned independently of mechanical or physical hydrogel properties, which could be advantageous in studying cell-matrix interactions. The Michael-type gelation chemistry is selective and happens at physiological conditions; hence, it allows for spheroid encapsulation by simply mixing the spheroids with the hydrogel precursor solution.
Overall, the methodology presented here has several notable characteristics. First, fabricating tumor spheroids in a multiwell assembly is efficient, quick, and the cost of the required materials is low. Second, the spheroids are produced in large batches in a variety of sizes with low polydispersity. Finally, only commercially available materials are required. The utility of the methodology is illustrated by exploring the effect of substrate properties on spheroid cell viability, circularity, and cell stemness.

저자 스포트라이트: 교모세포종 미세환경 연구를 위한 체외 하이드로겔 모델

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

Our lab focuses on designing in vitro hydrogel models for glioblastoma steroid encapsulation to mimic the tumor extracellular microenvironment. The effective substrate, mechanical and biochemical properties on steroid cell viability, circularity, stemness, and spreading are investigated with such models. Current experimental challenges in tumor module development revolve around a desire for complexity to mimic all aspects of the tumor microenvironment for physiological relevance, and also a desire for simplicity to make the model accessible, robust, low cost, and easy to use, and compatible with multiplex screening approaches.We present a protocol that enables fast, robust, and low-cost fabrication of tumor steroids and encapsulation in hydrogels made to mimic the tumor microenvironment. The model does not require any specialized equipment. It will be particularly useful for exploring steroid matrix interactions in building in vitro tissue physiology or pathology models.Understanding the interactions between glioblastoma cancer cells and their microenvironment can encourage development of new therapies to better treat this cancer. Furthermore, development of an in vitro model for glioblastoma cancer can enhance development of this model for other cancer diseases.

화학 요법 효과를 연구하기 위한 스페로이드 기반 약물 스크리닝 플랫폼은 자연 조직을 복제하는 생체 재료에서 스페로이드 캡슐화 시 종양 미세환경을 조절하는 데 중점을 두기 때문에 점점 더 많은 수요가 증가하고 있습니다. 여기에서 우리는 다세포 종양 스페로이드 제제와 3D 하이드로겔에서의 후속 캡슐화 및 이미징을 위한 방법을 개발했습니다. 스페로이드는 마이크로웰 몰드(<strong class="xf...

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여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

우리 연구실은 종양 세포외 미세환경을 모방하기 위해 교모세포종 스테로이드 캡슐화를 위한 시험관 내 하이드로겔 모델을 설계하는 데 중점을 둡니다. 스테로이드 세포 생존력, 원형도, 줄기 및 확산에 대한 효과적인 기질, 기계적 및 생화학적 특성은 이러한 모델로 조사됩니다. 종양 모듈 개발의 현재 실험 과제는 생리학적 관련성을 위해 종양 미세환경의 모든 측면을 모방하려는 복잡성에 대한 욕구와 모델을 접근 가능하고 견고하며 저렴하고 사용하기 쉽고 다중 스크리닝 접근 방식과 호환되도록 하는 단순성에 대한 욕구와 관련이 있습니다.당사는 종양 스테로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조하고 종양 미세환경을 모방하도록 만들어진 하이드로겔에 캡슐화할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 이 모델에는 특수 장비가 필요하지 않습니다. 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축할 때 스테로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하는 데 특히 유용할 것입니다.교모세포종 암세포와 미세환경 간의 상호작용을 이해하면 이 암을 더 잘 치료할 수 있는 새로운 치료법 개발을 장려할 수 있습니다. 또한, 교모세포종 암에 대한 시험관 내 모델의 개발은 다른 암 질환에 대한 이 모델의 개발을 향상시킬 수 있습니다.

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

796 조회수.  Saint Louis University. 우리 연구실은 종양 세포외 미세환경을 모방하기 위해 교모세포종 스테로이드 캡슐화를 위한 시험관 내 하이드로겔 모델을 설계하는 데 중점을 둡니다. 스테로이드 세포 생존력, 원형도, 줄기 및 확산에 대한 효과적인 기질, 기계적 및 생화학적 특성은 이러한 모델로 조사됩니다. 종양 모듈 개발의 현재 실험 과제는 생리학적 관련성을 위해 종양 미세환경의 모든 측면을 모?...