Para comenzar, use una espátula preenfriada para agregar 100 miligramos de polvo de tejido vegetal en un tubo de microcentrífuga de polipropileno escalonado. A continuación, añada inmediatamente un mililitro de metanol al 20% al tubo. Coloque el tubo tapado en una coctelera oscilante durante tres horas a temperatura ambiente.
A continuación, centrifugue el tubo a 9.464 g durante 10 minutos y recoja el sobrenadante en un vial de muestreador automático LC-MS. Configure un instrumento LC-MS con una fuente de ionización por electrospray y una columna de HPLC de fase inversa. Para HPLC, use ácido fórmico al 0,1 % en agua como solvente A y ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo como solvente B. Ajuste la temperatura del horno de columna a 45 grados centígrados y el caudal a 0,5 mililitros por minuto.
Equilibre la columna con 99%A y 1%B. Establezca un gradiente de 30 minutos para que la concentración de solvente B aumente de 1% a 50% durante 26 minutos, luego regrese rápidamente a 1%B a 26.01 minutos y manténgalo durante cuatro minutos. Configure los parámetros de funcionamiento del espectrómetro de masas.
Establezca el voltaje de la interfaz en cuatro kilovoltios, el flujo de gas de nebulización en tres litros por minuto y el flujo de gas de calefacción en 10 litros por minuto. Ajuste la temperatura de la línea de desolvatación a 250 grados centígrados, la temperatura del bloque de calor a 400 grados centígrados y la temperatura de la interfaz a 300 grados centígrados. Ajuste el flujo de gas de secado a 10 litros por minuto y la presión del gas de disociación inducida por colisión a 17 kilopascales.
Construya un método MS en modo positivo de fuente de ionización por electrospray, incluya escaneos Q3 y Q1 que cubran el rango de masa de 100 a 1,000 daltons con el escaneo Q1 que sirva como un evento de encuesta con exclusión automática de isótopos. Agregue un enlace de escaneo de iones de producto al escaneo Q1 con una ventana de masa de 50 a 1.000 daltons, una energía de celda de colisión de menos 20 voltios y un tiempo de evento de menos 0,2 segundos. A continuación, ajuste el método MS para agregar escaneos de iones precursores de modo positivo iguales a la longitud del método LC con energías de celda de colisión de menos 20 voltios y tiempos de evento de 0,75 segundos.
Asegúrese de que, en todos los casos, estén habilitadas las funciones automáticas de exclusión o desisótopo de isótopos. Establezca los valores de carga maestra para fragmentos de alcaloides tropanos monosustituidos, disustituidos y trisustituidos. A continuación, al método MS-MS, agregue escaneos de pérdida neutra de modo positivo iguales a la longitud del método LC con energías de celda de colisión de menos 20 voltios y tiempos de evento de 0,75 segundos.
Asegúrese de que, en todos los casos, estén habilitadas las funciones automáticas de exclusión o desisótopo isotópico. Establezca las masas de pérdida neutra de interés para los ésteres en alcaloides tropanos para los ésteres derivados del ácido tílico, los grupos acetilo y los ésteres de ácido fenilláctico o tropical. Descargue el método LC-MS y cree archivos de datos para las muestras de interés.
Una vez que la columna de HPLC esté equilibrada a 45 grados centígrados, inyecte de 10 a 20 microlitros de muestra.
