Fraccionamiento celular de islotes pancreáticos de macaco rhesus para secuenciación y metabolómica de ARN unicelular

Para comenzar, descongele el tejido aislado del islote pancreático del macaco rhesus en hielo. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis 0.1X al pellet de tejido. Con un mortero de pellets desechable sin RNasa, homogeneice suavemente el tejido 15 veces en hielo.

Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. A continuación, añada 500 microlitros de tampón de lavado al homogeneizado y mezcle suavemente con la pipeta con hielo. Prepare un filtro de preseparación de 30 micrómetros con 300 mililitros de tampón de lavado y filtre un mililitro de homogeneizado celular en un tubo de cinco mililitros.

Centrifugar el homogeneizado filtrado a 500 g durante cinco minutos en una centrífuga de cubo oscilante a cuatro grados centígrados. Con una pipeta, transfiera un mililitro del sobrenadante a un criovial en hielo y congélelo inmediatamente a menos 80 grados Celsius para futuros experimentos metabolómicos. Agregue un mililitro de tampón de lavado gota a gota al pellet de núcleos para resuspenderlo.

Girar el pellet lavado a 1.000 g durante cinco minutos en una centrífuga de cubo oscilante a cuatro grados centígrados. Después de repetir el lavado, vuelva a suspender los núcleos en un mililitro de tampón de lavado. Con una pipeta, mezcle 10 microlitros de suspensión de núcleos y 0,4% de azul de tripano en un tubo separado, y agregue la mezcla a un portaobjetos de contador de células automatizado.

Finalmente, usando un contador de células, determine la concentración de núcleos. Se obtuvo un núcleo intacto ideal para los experimentos de secuenciación. Sobre la base de los estudios de expresión génica, se obtuvo el agrupamiento UMAP de subtipos celulares dentro de islotes fetales aislados, no humanos, primates.

Utilizando las fracciones citosólicas se obtuvo la abundancia de metabolitos de los islotes, como fosfato de dihidroxiacetona, 3-fosfato de glicerol, 2-oxoglutarato, creatina y glutatión.