Este método permite la cuantificación del consumo de oxígeno a partir de un pequeño número de islotes de especies relevantes, como primates no humanos y humanos, lo que permite evaluar la función mitocondrial. Esta técnica se puede realizar con un pequeño número de islotes primarios, aumentando las réplicas técnicas, permitiendo la prueba de múltiples condiciones, y mejorando el rigor y la reproducibilidad del ensayo. Esta técnica evalúa la salud mitocondrial, un importante determinante de la función de los islotes y la secreción de insulina que a menudo se deteriora en la diabetes y es un predictor significativo del trasplante exitoso de islotes.
Es esencial asegurarse de que los islotes están localizados en el centro de los pozos después de la transferencia. Si no lo hace, se realizan mediciones inconsistentes de consumo de oxígeno. Demostrar este procedimiento será, Valerie Ricciardi, una estudiante de pregrado que trabaja en mi laboratorio.
El día antes del ensayo, añadir 200 microlitros de células y adhesivos de tejido a 2,8 mililitros de solución de bicarbonato sódico molar 0,1 y añadir 20 microlitros de la solución resultante a la parte inferior de cada pocero de una microplaca esferoide de 96 pozos. Asegúrese de que las burbujas de aire se retiren de la punta de la pipeta. Cuando se hayan cargado todos los pozos, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono no carbono de 37 grados Celsius.
Después de una hora, aspirar la solución adhesiva celular de la placa dentro de un ambiente estéril y lavar cada pozo dos veces con 400 microlitros de 37 grados Celsius agua estéril. A continuación, deje que los pozos se sequen al aire durante 30 a 40 minutos antes de cubrir la placa para el almacenamiento durante la noche a cuatro grados centígrados. Para hidratar el cartucho del sensor, en un entorno estéril abra el paquete del cartucho del sensor y retire el contenido.
Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicio y llene cada pozo de la placa de servicio con 200 microlitros de agua estéril. Cuando se hayan cargado todos los pozos, baje el cartucho del sensor en la placa de servicio y coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad montados en la incubadora de dióxido no carbono de 37 grados Celsius durante la noche. El día del ensayo, retire la tapa del cartucho del sensor y decante el agua de los pozos de la placa de servicio.
Agregue 200 mililitros de calibrador preadmanificado a cada pozo y reemplace la tapa del cartucho del sensor. A continuación, vuelva a colocar el cartucho del sensor en la incubadora durante aproximadamente una hora. Para preparar los islotes para su transferencia, escoja a mano los islotes en un plato de cultivo celular de 60 por 15 milímetros que contenga un medio ensamblado a una pureza cercana al 100%.
Cuando se hayan recogido todos los islotes, cargue cada pocillo de la microplaca esferoide preparada con 175 microlitros de medio ensamblado y utilice una pipeta P20 en 15 microlitros para aspirar 15 islotes en 15 microlitros de medio de la placa de cultivo celular. Para sembrar los islotes en la microplaca esferoide, baje la punta de la pipeta a la parte inferior del pozo, apenas levante la punta y dispense lentamente alrededor de cinco microlitros de medio. Para cargar los islotes en los pozos, deje que los islotes se asienten en la punta de la pipeta antes de soltarlos suavemente directamente sobre la parte inferior del centro del pozo en un pequeño volumen de medio.
Confirme que todos los islotes han dejado la punta de la pipeta, revisando ocasionalmente la microplaca esferoide bajo el microscopio para verificar que los islotes se siembran en la parte inferior de la placa y no se pegan a los lados de los pozos. Cuando se hayan transferido todos los islotes, coloque la microplaca en la incubadora de dióxido de carbono celsius de 37 grados. Antes de iniciar el procedimiento de ensayo, cargue el puerto A del cartucho del sensor con 20 microlitros de oligomicina micromolar 45 recién preparada, puerto B con 22 microlitros de 10 micromolares FCCP recién preparados y puerto C con 25 microlitros de 25 micromolares AA recién preparados. A continuación, programe un ensayo de analizador de flujo extracelular para un período de respiración basal de 30 minutos, un período de medición de oligomicina de 42 minutos, un período FCCP de 30 minutos y un período de rotenona AA de 30 minutos.
A continuación, ejecute el ensayo siguiendo las instrucciones de la pantalla para calibrar el sensor e insertar la microplaca. Para la entrega de islotes a la placa de ensayo, se deben aspirar 15 islotes en 15 microlitros de medio como se ilustra. Esta técnica dará lugar a la colocación constante de islotes en el centro inferior de cada pozo de microplacas, lo que permite mediciones precisas de consumo de oxígeno.
En este experimento representativo que muestra el consumo de oxígeno de pozos individuales, los pozos estaban mal cargados, lo que resultó en un nivel basal muy bajo de consumo de oxígeno y poca o ninguna respuesta a FCCP. En este experimento, la mayoría de los pozos demostraron una respiración basal significativa y una respuesta a los medicamentos. Sin embargo, dos pozos no mostraron ninguna respuesta a la rotenona, lo que sugiere que la droga no fue liberada correctamente en el pozo.
Estos pozos fueron excluidos de nuevos análisis. Aquí, se pueden observar los resultados de un ensayo exitoso en el que los pozos se cargaron correctamente con islotes y se inyectaron correctamente con drogas. Es beneficioso preparar los reactivos y placas el día antes de realizar el ensayo para permitir que los islotes se utilicen poco después de que se aíslen o reciban.
Después del ensayo, los islotes se pueden recuperar para la extracción de proteínas o ADN para normalizar los datos de consumo de oxígeno o para cuantificar el contenido de ADN mitocondrial. La capacidad de medir la función mitocondrial en un pequeño número de islotes primarios de primates permite la prueba de múltiples fármacos y otras manipulaciones en una sola réplica biológica. Las personas que trabajan con islotes primarios de primate deben estar seguros de ser entrenados en el manejo adecuado y seguro con estos tejidos.
En particular, el uso de un equipo de protección personal adecuado y la eliminación adecuada de estas muestras.
