Colección de matriz subendotelial de cultivos de células endoteliales microvasculares (REC) de la retina para la medición de la rigidez del microscopio de fuerza atómica (AFM)

Para comenzar, enjuague los cubreobjetos recubiertos de gelatina reticulada con glutaraldehído en PBS que contiene calcio y magnesio unas cinco veces en un agitador orbital. Durante los tres primeros enjuagues, levante los cubreobjetos con una pinza estéril para permitir un enjuague completo del glutaraldehído. A continuación, sustituya el medio de cultivo de los REC de ratón por un medio fresco suplementado con ácido ascórbico estéril y filtrado.

Después de 15 días de tratamiento, enjuague las células con PBS libre de calcio y magnesio. Incubar las células en 250 microlitros de tampón de descelularización tibio durante dos o tres minutos. Confirmar la descelularización de las células bajo un microscopio de contraste de fase.

Pipetear suavemente el tampón sin alterar la matriz subendotelial secretada por REC. A continuación, añada 0,5 mililitros de PBS en cada pocillo. Después de eliminar el PBS, agregue 200 microlitros de DNasa libre de RNasa.

Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos para eliminar todos los residuos celulares. A continuación, observe la matriz subendotelial fibrosa a macroescala bajo un microscopio de contraste de fase. A continuación, utilice un microscopio confocal para ver las fibras más finas de la matriz a nanoescala con un aumento de 100x.

Se observaron agregados de matriz subendotelial en los cubreobjetos de vidrio después de la descelularización de cultivos de REC de 10 o 15 días de humanos o ratones. La microscopía confocal de las matrices descelularizadas mostró una matriz densa de colágeno-IV y fibronectina nanofibrilar.