Para comenzar, coloque el tampón de bloqueo esterilizado con filtro recién preparado, el tampón de reacción 10X uno y dos en una plataforma de trabajo. Coloque tubos abiertos que contengan 2,5 mililitros de tampón de bloqueo y cinco mililitros de agua ultrapura en un desecador y desgasifique al vacío. Después de 15 minutos, libere la presión y retire los tubos.
Coloque el conjunto de celda de flujo de biotina-PEG preparado en una platina de microscopio y asegúrelo con masilla adhesiva en cada extremo. Conecte el tubo de salida de la celda de flujo a la bomba de jeringa mediante una aguja. Encienda el calentador del objetivo a 30 grados centígrados.
Asegure uno o dos mililitros de agua desgasificada en un tubo a una pieza separada de masilla adhesiva cerca de la celda de flujo. Inserte el tubo de entrada en el tubo hasta que llegue al fondo y haga fluir el agua a través del canal. Aumente el caudal para eliminar las burbujas atrapadas cerca del tubo de entrada.
Agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo desgasificado a una alícuota de 20 microlitros de un miligramo por mililitro de estreptavidina. Fije el tubo abierto a la masilla adhesiva. Transfiera el tubo de entrada del agua a la estreptavidina e inicie el flujo a una velocidad de 40 microlitros por minuto durante dos minutos.
Después de cinco minutos, lave el exceso de estreptavidina con el tampón de bloqueo. Flujo en ADN biotinilado diluido en tampón bloqueante que contiene 25 nanomolares SYTOX Orange. Imagen usando live view con el láser de 532 nanómetros para ver el ADN que se adhiere a la superficie en tiempo real.
Una vez que se alcanza la densidad deseada de ADN en la superficie, fluye en un tampón de bloqueo que contiene 25 nanomolares SYTOX para lavar el ADN libre. Ahora, el anticuerpo anti-digoxigenina bitinilado y de flujo diluido en tampón bloqueante que contiene 25 nanomolares SYTOX Orange. Lavar el anticuerpo anti-digoxigenina biotinilado y SYTOX Orange con tampón bloqueante.
Fluya 50 microlitros de mezcla de ATP-gamma-S en la celda de flujo. Agregue helicasa CMG purificada a concentraciones finales de aproximadamente 100 nanomolares en 30 microlitros de mezcla de ATP-gamma-S y fluya a 20 microlitros por minuto durante 20 microlitros. Incubar durante 15 minutos.
A continuación, fluya en la mezcla de ATP RPA a 40 microlitros por minuto durante 80 microlitros. Usando cada láser con una exposición de 50 a 100 milisegundos, visualice y adquiera EGFP RPA con un láser de 488 nanómetros, luego adquiera CMG con un láser de 640 nanómetros. Finalmente, visualice y adquiera ADN teñido de naranja SYTOX con un láser de 532 nanómetros.
El desenrollamiento del ADN de la helicasa CMG se visualizó mediante el crecimiento lineal del RPA amarillo rastreado a lo largo del tiempo, lo que indica las hebras de ADN desenrolladas. El daño en el ADN monocatenario redujo el número de eventos de desenrollado exitosos observados, como lo demuestra la menor cantidad de rastros completos en los datos.
