Nuestro protocolo está diseñado para sondear los mecanismos biofísicos que rigen el transporte de carga por equipos de proteínas motoras citoesqueléticas idénticas o dirigidas opuestamente. Mediante el uso de origami de ADN para la construcción molecular, este método puede elegir el tipo, el número y la ubicación de los motores en formas de carga definidas con precisión. Mientras que este protocolo se centra en los motores basados en microtúbulos dynein y kinesina, es adaptable a la miosina motora basada en actina, así como a otros sistemas de proteínas que funcionan de forma cooperativa.
Un aspecto desafiante de este protocolo es mantener la integridad y la actividad de las proteínas motoras durante todo el proceso de purificación, ya que son sensibles al calor y a la fuerza mecánica. Para inducir el crecimiento y la expresión de proteínas motoras a través del promotor de la gactosa, utilice una varita de inoculación estéril para rayar la cepa de levadura congelada de interés en una placa de cultivo de levadura-peptona-dextrosa para una incubación de tres a cuatro días a 30 grados centígrados. En el cuarto día de cultivo, cuando la densidad óptica a 600 nanómetros está entre 1,5 y dos, recoger las células de levadura por centrifugación, y resuspender el pellet en agua para lavarlas y consolidar las células en una sola botella.
Girar las células de nuevo para la recolección, y resuspender el pellet en unos dos mililitros de agua de doble destilado. Luego use una pipeta de 10 mililitros para dispensar lentamente la lodo celular en nitrógeno líquido una gota a la vez para producir pellets de células de levadura congeladas. Para la purificación de proteínas de motor, utilice una trituradora de café de tipo cuchilla pre-enfriada con nitrógeno líquido para moler los pellets de levadura congelada en un polvo fino, y transfiera el polvo de levadura a un vaso de vidrio pre-enfriado, de 100 mililitros, sobre hielo.
Añadir un pequeño volumen de tampón de lisis 4X recién preparado con suplementos al polvo para que la concentración final del tampón no exceda 1X, y colocar el vaso de precipitados en un baño de agua Celsius de 37 grados con agitación continua con una espátula para descongelar rápidamente el polvo. Añadir tampón 4X adicional con suplementos para llevar la concentración de búfer final a 1X en el lisato. El volumen final es a menudo entre 25 y 30 mililitros.
Luego recoger las células de levadura por centrifugación, y transferir la proteína soluble que contiene sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para la purificación de afinidad IgG, agregue 200 microlitro de suspensión de cordón de afinidad lavado al extracto de proteína, e incubar la mezcla a cuatro grados Centígrados durante una hora con rotación suave. Al final de la incubación, filtrar la mezcla a través de la misma columna de cromatografía utilizada para preparar las cuentas a cuatro grados Celsius, seguido de dos lavados con cinco mililitros de tampón de lavado por lavado en hielo.
Después del segundo lavado, enjuague las perlas sobre hielo con cinco mililitros de tampón TEV, permitiendo que el tampón drene completamente de la columna. Para el etiquetado de oligonucleótidos de ADN, tape la columna de cromatografía e incubar las perlas del motor con 100 microlitros de Tampón TEV complementados con 10 a 20 micromolares del oligo de bencilguanina purificado a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, reutilizando suavemente las perlas una vez por minuto. Al final de la incubación, lave las perlas cuatro veces con tampón TEV fresco por lavado como acaba de demostrarse, antes de recapetute la parte inferior del tubo para permitir la resuspensión de las perlas del motor en no más de 200 microlitros de tampón TEV fresco.
Para el escote TEV, transfiera la suspensión del cordón del motor a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, fondo redondo, e incubar las perlas del motor con aproximadamente 0,3 unidades de proteasa TEV por microlitro de mezcla de perlas de motor a 16 grados Celsius durante una hora con rotación suave. Al final de la incubación, centrifugar las perlas del motor, y recoger la mezcla en la parte inferior del tubo. A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 cortada para transferir la mezcla a una columna de centrifugado, y centrifugar la mezcla como se acaba de demostrar.
Recoger el filtrado que contiene los motores tev-cortados, purificados, y alícuota el filtrado en volúmenes de 50 microlitros para la purificación de la afinidad de microtúbulos. A continuación, congele las alícuotas en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para la purificación del chasis, a última hora de la tarde del día anterior a la purificación, caparga suavemente 80 microlitros cada uno de la concentración de glicerol en el tampón plegable de origami en un tubo centrífugo.
Los límites entre las capas deben ser ligeramente visibles. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados, capa 10%glicerol en tampón plegable de origami en la solución de chasis plegado sobre la capa superior del gradiente, y centrifugar el gradiente con el chasis. Al final de la centrifugación, recoge fracciones de 50 microlitros del gradiente en una dirección de arriba a abajo, y carga cinco microlitros de cada fracción en pozos individuales de un gel de agarosa del 2%.
Después de 90 a 120 minutos a 70 voltios, imagen del gel utilizando condiciones adecuadas para la mancha de gel de ADN utilizada. Las concentraciones cuantificadas de las fracciones de interés seleccionadas se pueden determinar utilizando los métodos espectroscópicos estándar adecuados. El análisis SDS-PAGE se puede utilizar para confirmar la extracción exitosa de dynein de levadura, ya que el filtrado final muestra una banda clara y afilada a aproximadamente 350 kilodaltons.
TEV proteasa también está presente en el filtrado final y forma una banda clara a unos 50 kilodaltons. Después de la purificación de la afinidad de microtúbulos, dynein aparece como una banda clara, una sola a 350 kilodaltones, mientras que la kinesina se puede observar como un poco manchado, múltiples bandas a unos 120 kilodaltons. Además de la proteasa del TEV, también se puede observar una cantidad notable de tubulina en el sobrenadante final.
El plegado de las estructuras de origami de ADN puede ser ensayado por electroforesis de gel de agarosa, con un cambio en la movilidad entre el hilo de andamios desdoblado puro y la reacción plegable que indica el plegado de origami. Además, la reacción de plegado indica la presencia de alguna multimerización de las estructuras del chasis. La motilidad de los conjuntos de chasis de motor es fácilmente detectable y medible en los kymographs generados a partir de películas TIRF, ya que los kymographs de chasis flexible conjugados con siete proteínas de dynein demuestran corridas altamente procesivas a velocidades relativamente consistentes.
Es vital controlar cuidadosamente la temperatura de las proteínas motoras en cada paso del procedimiento. Tras la purificación de las proteínas motoras y el chasis de origami de ADN, los dos componentes se pueden conjugar para ensayos de motilidad de los conjuntos bajo un microscopio TIRF. Este método permite descifrar los mecanismos biofísicos y bioquímicos que rigen la motilidad emergente de los conjuntos motores.
