Nuestro protocolo ayuda a la oxigenación por imágenes de esferoides multicelulares utilizando un microscopio de fluorescencia convencional. Usando este método, uno puede producir miles de microtisones esferoides teñidos con sonda de oxígeno y posteriormente usarlos en aplicaciones de impresión 3D. Por ejemplo, injertos de tejido óseo vascularizado.
La sonda de oxígeno en el infrarrojo cercano es compatible con el uso de otros colorantes, como la tinción de fluorescencia verde de En última instancia, esto permite el análisis a largo plazo en vivo y multiparamétrico. Transfiera sellos PDMS micropatronados de un vial de almacenamiento a una placa de Petri estéril y seque al aire con la superficie lisa bajo las condiciones de flujo de aire laminar estéril durante 10 minutos. Coloque cada sello en el medio del pozo de una placa de cultivo de tejido estéril de 12 pocillos.
Secar al aire durante uno o dos minutos con una tapa abierta. Prepare 50 mililitros de solución de agarosa homogénea al 3% e inmediatamente agregue aproximadamente dos mililitros de solución de agarosa caliente a cada pocillo de las placas de 12 pocillos para cubrir el sello PDMS insertado. Solidificar la agarosa durante 20 minutos incubándola bajo flujo de aire estéril.
Usando una espátula estéril, gire la agarosa con el sello PDMS incrustado boca abajo en cada pozo. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua estéril en la parte superior lisa del sello. Separarlo de la agarosa con una espátula y retirarlo del pozo.
Agregue un mililitro de los medios de cultivo celular estéril correspondientes a los sellos de agarosa para uso directo. Cubra el plato con la tapa e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Antes de usar, caliente las placas micro-patronadas de agarosa durante una hora a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono.
Enjuague el cultivo celular de confluencia del 70% al 90% con PBS precalentado. Agregue la solución enzimática disociante e incube durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Más tarde, neutralice la tripsina con medios de cultivo celular completos que contengan 10% de FBS.
Para obtener una suspensión de una sola célula, disocie los agregados celulares utilizando una punta de pipeta de 1.000 microlitros en la parte superior de la pipeta serológica. Usando una cámara de conteo, cuente el número de células por mililitro de la suspensión celular. Diluya la suspensión celular a 500, 000 células por mililitro y agréguele una solución de sonda de oxígeno concentrado.
Retire los medios viejos de los pocillos micropatronados de la placa de cultivo celular recubierta de agarosa de 12 pocillos y agregue un mililitro de la suspensión celular preparada a los pocillos. Cultive los esferoides en una incubadora de dióxido de carbono durante dos a cinco días en presencia continua de la sonda de oxígeno para garantizar que se cargue durante la formación y compactación de esferoides. Cierre el extremo de un cartucho estéril de tres centímetros cúbicos con una tapa de punta y llene con tinta biológica mediante pipeteo.
Inserte un émbolo en el cartucho y manténgalo boca abajo. Retire la tapa de la punta y empuje el émbolo hacia la tinta biológica hasta que se elimine todo el aire del cartucho. Enfríe la tinta biológica en el manto de calentamiento de la bioimpresora a 23 grados centígrados.
Rocíe la bioimpresora con etanol al 70% y séquela con papel absorbente. Atornille un adaptador de presión en la parte superior del cartucho. Monte una aguja cónica de polietileno de calibre 22 en el cartucho.
Instale el cartucho en el manto calefactor del cabezal de impresión basado en extrusión. Enchufe la entrada de presión y abra el clip en la entrada. Cargue el archivo G-code de su diseño en el software de impresión.
Inicie la medición de la longitud de la aguja. Regula la presión de impresión dispensando un poco de bio tinta en una placa de Petri estéril. Instale una placa de seis pocillos, abra la placa del pozo, cierre la campana e imprima.
Después de la impresión, deje que los andamios se entrecrucen físicamente durante 10 minutos a cinco grados centígrados. Irradia los andamios impresos durante 60 segundos con una lámpara LED ultravioleta. Agregue inmediatamente el medio de crecimiento correspondiente que contenga solución antibiótica dual a todos los pozos con rejillas bioimpresas.
Cultive los andamios a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Para la observación de microscopía, transfiera una rejilla de gofre impresa a una cubierta de plato de microscopía con medios de imagen. Usando una pipeta de un mililitro, lave suavemente los esferoides preteñidos de la sonda de oxígeno de los micropocillos de agarosa y transfiéralos a un tubo inferior cónico de 15 mililitros.
Para garantizar la recolección de todos los esferoides de un pozo microestamplado, enjuague el pozo de una a tres veces con el mililitro adicional de medios de cultivo y combine todas las suspensiones de esferoides en un vial. Deje el vial vertical durante un máximo de 10 minutos para dejar que los esferoides se asienten en la parte inferior. Retire con cuidado el medio del tubo dejando los esferoides intactos.
Agregue un medio de cultivo fresco que sea suficiente para al menos 20 esferoides por plato de muestra y resuspenda suavemente los esferoides mediante pipeteo. Agregue inmediatamente un volumen igual de suspensión de esferoides a cada pozo de microscopía pre-recubierto. Deje los esferoides durante una hora a 37 grados centígrados para que se adhieran a la superficie del pozo de microscopía.
Retire bien el medio de la microscopía y enjuague una vez con medios de imagen. Agregue la cantidad exacta de medios de imagen a la muestra. Configure el pozo de microscopía con esferoides teñidos en la etapa de microscopía.
Usando el objetivo de aumento de 10X, obtenga una vista previa de la muestra en la luz de transmisión. Haga un enfoque preliminar en los esferoides, ubíquelos en el centro de la imagen y lleve el objetivo con el alto aumento requerido a la posición de trabajo. Concéntrese en el modo de luz de transmisión en la sección transversal ecuatorial del esferoide.
Ajuste la configuración para recopilar señales de fluorescencia o fosforescencia de referencia y canales espectrales sensibles de la sonda de oxígeno e inicie el proceso de obtención de imágenes. Abra el archivo vsi con datos de intensidad de la sonda de oxígeno de los canales espectrales de referencia y sensibles en modo combinado. Abra la ventana de la función de análisis de ratios desde el menú de medidas.
Elija la intensidad del canal de referencia como numerador y la intensidad del canal sensible como denominador para el cálculo de R. En la ventana de análisis de ratio, aplique los ajustes de umbral de intensidad correspondientes a cada canal espectral para restar el fondo de la imagen de intensidad combinada. Las máscaras ROI aplicadas a imágenes esferoides determinan los bordes esferoides.
Aumente los valores umbral hasta que el fondo de la imagen sea uniformemente negro. En la ventana de análisis de ratio, ajuste el factor de escala a la imagen de ratio hasta que la imagen de vista previa proporcione la resolución deseada del degradado R. La imagen de distribución de la relación de intensidad se agrega como una capa a la imagen multicanal original.
En la ventana de la imagen multicanal, active la capa con una barra de color falsa. Determine manualmente los límites de vinculación y desvinculación de un histograma de distribución de ratios mediante la opción de escala fija de la ventana de visualización de ajuste. Abra la imagen de luz de transmisión correspondiente de los esferoides.
Elija la función de regla lineal y mida el diámetro de los esferoides. Exportar datos como un archivo de tabla de hoja de cálculo. Elija el ROI del tamaño y la forma requeridos y aplíquelo a la periferia y al núcleo hipóxico del esferoide.
Transforme el ROI en el objeto de medición para analizar el R promedio dentro del ROI elegido. Exporte datos en un formato de tabla compatible con hojas de cálculo. Aplicar mediciones a cada sección de microscopía de esferoides para obtener el conjunto de datos de diámetros de esferoides RC y RP para realizar cálculos adicionales y comparación estadística.
Combine todos los datos en un archivo de hoja de cálculo. La sonda MMIR1 tiene un fotoblanqueo bajo y es adecuada para el estudio en tiempo real de la respuesta respiratoria rápida en esferoides hDPSC a diferentes estímulos mitocondriales. FCCP mostró solo un efecto de desacoplamiento leve en algunas áreas y luego disminuyó ligeramente la respiración celular.
Por otro lado, la rotenona inhibió fuertemente la respiración, lo que llevó a la reoxigenación esferoide y la disipación de los gradientes de oxígeno de la periferia al núcleo dentro de aproximadamente 80 segundos después de la estimulación. Utilizando el protocolo automatizado de cálculos de relación de intensidad píxel por píxel proporcionado por el software de imágenes, los gradientes de oxígeno de periferia a núcleo detectados en tiempo real en todos los tipos de esferoides se visualizan con la periferia oxigenada y los nichos hipóxicos en el centro. Los gráficos aquí representados representan perfiles de proporción de las secciones transversales de esferoides ecuatoriales para diferentes tipos de esferoides.
En comparación con los esferoides homocelulares hDPSC, los esferoides heterocelulares hDPSC a HUVEC tuvieron gradientes significativamente más pronunciados. El gradiente de oxígeno de la periferia al núcleo en los esferoides heterocelulares es probablemente generado por hDPSC en su composición de acuerdo con la oxigenación de los esferoides hDPSC que tienen una fuerte actividad respiratoria. Los gráficos muestran que los esferoides hDPSC bioimpresos tenían una periferia significativamente oxigenada que los esferoides medidos antes de la bioimpresión, mientras que su oxigenación central tenía valores similares.
Si la precipitación ocasional de la sonda perturba la formación uniforme de esferoides, filtre o centrífique la solución de la sonda a alta velocidad antes de su uso. La corrección de la medición de la longitud de la aguja y la regulación de la presión son pasos esenciales para que coincidan con la tasa de bioimpresión y el diámetro del puntal y los microagregados de bioimpresión en un andamio poroso. Elija la configuración de microscopía para las imágenes de sonda sensibles al oxígeno, teniendo en cuenta su efecto sobre la fotoestabilidad de la sonda.
Las imágenes de oxígeno son compatibles con muchos tipos de mediciones de microscopía en vivo. Después de la toma de imágenes, también se puede realizar inmunofluorescencia, extraer proteínas para Western blotting o realizar análisis de expresión génica.
