Interne institutionelle Fonds und der Biological Sciences Scholars Program an der University of Michigan unterstützt diese Arbeit.

Worm Vorbereitung <ol><li> Transfer-L4 Larvenstadien Würmer, geeignete Platten 18-24h vor der Aufnahme 22. Dies wird sicherstellen, dass Sie Ei-tragenden Erwachsenen für eine reichliche Versorgung von frühen Embryonen. </li><li> Bereiten Tuben Vaseline und Agarose. Wir bereiten mehrere 15mL Falcon-Röhrchen durch Schmelzen Vaseline in einem Becherglas in die Mikrowelle und Abgabe in 4-5 mL Aliquot pro Röhre. Ebenso schmelzen 2-3% (w / v) Agarose in Puffer (M9 oder Egg Buffer) und aliquote 4-5 ml in Falcon-Röhrchen. Achten Sie darauf, um überschüssige kochen, um die Verdunstung zu minimieren. Am Tag der Bildgebung, schmelzen 1 Tube Vaseline in einem 65-70 ° C Heizblock und schmelzen 1 Tube Agarose in der Mikrowelle, wieder vorsichtig zu minimieren Überkochen. Bewahren Sie die Rohre in der Hitze Block auf die Vaseline und die Agarose in geschmolzenem Zustand zu halten. </li><li> Machen Agarose-Pad. Position eine neue Mikroskopie slide zwischen 2 Führungsschlitten, die Dias durch eine einzige Schicht von gemeinsamen Labor beklebte nach oben und unten auf jeder Führungsschlitten abgedeckt sind. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit Ende off zu 2-3 Tropfen geschmolzenen Agarose auf der neuen Folie Stelle gebrochen. Abdeckung mit einer 2 nd Bild senkrecht zur Dia-Original, so dass es und deckt hilft, die Agarose Ausbreitung einer dünnen quadratischen Pad schaffen. Die 2 nd Folie sollte über dem Klebeband auf dem Führungsschlitten ruhen. Die Agarose-Konzentration auf 5% für dickere Pads erhöht werden. </li><li> Mit einem Binokular und ein Platindraht &quot;pick&quot;, Transfer 2 Erwachsene Würmer auf einen 9-12μL Tropfen M9 oder Egg Buffer auf einem 18 mm x 18 mm Deckglas. </li><li> Cut Würmer öffnen mit einer Nadel (wir verwenden 27G1 / 2 Nadeln) oder Skalpell, um Embryonen freizugeben. Versuchen Sie, in der Mitte der Wurm abgeschnitten. </li><li> Lower Agarose-Pad (mit dem Agar Seite nach unten) auf die 18x18 mm Deckglas mit den Embryonen. Trim-Agar, die sich von der Kante des Deckglases mit einer Rasierklinge. </li><li> Seal Deckglas mit einem Pinsel oder dünnen Holzstäbchen in die geschmolzene Vaseline, um alle vier Kanten des Deckglases gelten. </li></ol> Alternative zu Agar Reittiere sind hängende Tropfen 23, wenn Embryonen anfällig für Druck sind (dh wenn die Eierschale nicht richtig bilden). Imaging kann auch in utero durchgeführt werden, um die Befruchtung oder frühen Ereignisse wie die Meiose zu folgen. Worms sollte betäubt mit Levamisol 24. Um die Zahl der Embryonen, die von einem bestimmten Stadium der Entwicklung zu erhöhen, können mehrere Würmer auf einmal und die Embryonen zusammen vorsichtig mit einer feinen Spitze-Pipette oder eine Wimper Pinsel positioniert oder durch Pipettieren mit dem Mund seziert werden. 4D Nomarski DIC (Differential Interference Contrast) Movies <ol start="8"><li> Schalten Sie die Olympus BX61 Mikroskop. Da die Kamera ist empfindlich gegen elektromagnetische Wellen von anderen Geräten ausgesendet wird am letzten, die Quecksilberkugel (ggf. für GFP oder Fluoreszenz) zum ersten Mal eingeschaltet. Starten Micro-Manager einmal alles auf. Wählen Sie die entsprechende Konfigurationsdatei für DIC oder Fluoreszenz-Bildgebung. Der wesentliche Unterschied ist, dass die DIC-Datei enthält nicht die Kontrolle über fluoreszierende Verschlusszeit. Jede Datei wählt auch den entsprechenden Filter-Würfel und Kamera Gain-Einstellung. </li><li> Suche Embryonen unter dem Mikroskop mit 10-fach Objektiv. Suche in der Nähe Wurm Stellen für Gruppen von jungen Embryonen, um mehrere Embryonen innerhalb der Imaging-Bereich zu bekommen. Vermeiden Embryonen innerhalb der Wurm für die besten Bilder. </li><li> Mit dem Software-Schalter, um eine höhere Vergrößerung (40x bis 100x) und Auflösung (NA 0,9 bis 1,4) Ziel für die Bildgebung. </li><li> Passen Nomarski DIC Optics (Die folgenden Websites enthalten hilfreiche Erklärung DIC-Optik und die Terminologie; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> Auf unserer Olympus BX61 die wichtigsten Komponenten sind: <ol><li> Polarizer - Schieberegler unterhalb des Kondensators </li><li> Kondensator Wollaston-Prisma - Turm auf dem Kondensator, knapp unterhalb der Bühne. </li><li> Ziel Wollaston-Prisma - Schieberegler unterhalb des Filterwürfel </li><li> 2. Polarisator (Analyzer) - Filter Würfel in der DIC Position </li></ol></li><li> Schalten Filter Cube zu DIC dem Analyzer (2 nd Polarisator) in den Strahlengang (Software sollte diese beim Start tun) Position. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die beiden Polarisatoren richtig ausgerichtet sind (gekreuzt). Wenn beide Wollastonprismen außerhalb des Lichtweges das Sichtfeld sollte dunkel sein. Wenn nötig, drehen Sie den Polarisator unter dem Kondensor, bis diese korrekt ist. </li><li> Legen Sie das Ziel (oberen) Wollaston-Prisma in den Strahlengang. </li><li> Drehen Sie den Revolver auf den Kondensator der Wollaston-Prisma, dass das Ziel Sie mit Spielen wählen. </li><li> Passen Schieberegler unterhalb dieser Revolver NA des Objektivs übereinstimmen. </li><li> Fokus des Kondensators für eine optimale Koehler Beleuchtung. </li><li> Stellen Sie die obere Wollaston Prism, um eine optimale Kontrast durch Drehen des Knopfes auf dem Schieber zu bekommen. </li><li> Andere Einstellungen durch Software-Startup gesteuert werden, sind Kamera zu gewinnen (Wert 0) und wechseln Sie in das Speichern von Dateien als 8-Bit nicht 16-Bit-TIFF-Dateien. </li></ol></li><li> Passen Sie Licht Ebene schönes Bild zu geben. (In der Regel verwenden 4,7 Volt) (gesteuert durch Software). Wir bevorzugen es, die Probe so, dass die hellsten Pixel direkt unter Sättigung sind zu beleuchten. Gute DIC-Optik ergibt sich ein Bild mit einer 3-dimensionalen schauen, wo der Dotter in den Embryo deutlich abhebt. Alternativ kann dies beschrieben als ob das Licht Beleuchtung der Probe scheint aus einem Winkel leuchten, so dass die eine Seite der Probe (oder Funktionen in der Probe) ist hell und leuchtet die gegenüberliegende Seite in den Schatten und erscheint dunkler werden. </li><li> Wählen Sie Region Of Interest (ROI), um die Embryonen möchten Bild enthalten, klicken Sie auf Set ROI-Taste, um Fenster zu verkleinern. </li><li> Öffnen Sie die mehrdimensionale Erfassung Fenster. Wählen Sie Z-Stapel (Scheiben) und Zeitpunkten. </li><li> Verwenden Mikroskop Fokusknopf an der Unterseite des Embryos (letzte Brennebene mit einigen Dotterschollen im Fokus) zu finden. Klicken Sie auf Wählen Sie unten. Wiederholen, um zu ermitteln, und der Oberseite des Embryos. Wir verwenden normalerweise 1 Mikron Schrittweite und am Ende mit ~ 20 Fokusebenen. Wir sammeln in der Regel mehrere Fokusebenen zu jedem Zeitpunkt, da die Embryonen und Zellen relativ dick sind. Neben allem, wenn Zellen in unterschiedlichen Orientierungen teilen beginnen sie andere Zellen um verdrängen in den Embryo bewegt sie in die oder aus der ursprünglichen Fokalebene. Wenn Ihr Mikroskop keinen Fokus-Motor können Sie manuell den Fokus auf die Zelle oder Prozess, den Sie interessiert sind, folgen. </li><li> Eingabe Anzahl von Zeitpunkten und Zeitintervall benötigt. Wir verwenden normalerweise 15 Sekunden-Intervall und legen Sie einen max von 500 Zeitpunkten. Wir beginnen mit mehr Zeitpunkten, als wir brauchen werde und stoppen den Erwerb, wenn gewünscht. Wenn Sie Imaging mehrere Fokusebenen sind, stellen Sie sicher, es ist genug Zeit, um all die Fokusebenen in dem Intervall zwischen den Zeitpunkten zu erwerben. </li><li> Wählen oder erstellen Sie einen Speicherort für die Daten zu speichern. Stellen Sie sicher, dass die Software so eingestellt ist, letzte Bild nur angezeigt werden. Geben Sie der Datei einen Namen ein und klicken Sie übernimmt. Überwachen Sie die automatisierte Bildaufnahme für die ersten paar Mal Punkte, damit es richtig funktioniert. </li><li> Klicken Sie auf Stop, wenn Sie auf den Erwerb beenden möchten, um 10-fach Objektiv wechseln und bereiten nächsten Folie. </li><li> Wenn Sie fertig sind bildgebende entfernen DIC-Komponenten aus dem Strahlengang. Sauberes Öl aus objektiven, wenn nötig. Schalten Sie alles ab, beginnend mit der Kamera. </li></ol> GFP Movies <ol start="20"><li> Starten Mikroskop und finden Embryonen wie oben beschrieben. Verwenden Konfigurationsdatei, die Software-Steuerung von Fluoreszenz-Shutter schließt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der obere DIC-Prisma (Schieberegler) nicht in den Strahlengang. </li><li> Schalten Filter Cube zu FITC / GFP (automatisch beim Start gesetzt) </li><li> Ändern Kamera zu gewinnen, um 255 und Image-Datei auf 16-Bit-Tiff (automatisch beim Start mit dieser Konfigurationsdatei gesetzt). </li><li> Schalten Sie weißes Licht. </li><li> Klicken Sie auf Live Imaging, um Vorschau-Bild. Arbeiten Sie schnell ans Licht zu minimieren. Alternativ können Sie Snap-Image to einzelnes Bild zu sammeln. </li><li> Passen Sie Mercury Lampe power / Neutralfilter, Belichtung Länge um ein gutes Bild zu bekommen. In der Regel sollten Sie mindestens Licht erreicht die Probe auf die gewünschten Daten zu Lichtschäden an der Zelle und Ausbleichen der Fluoreszenz-Signale zu reduzieren erwerben. </li><li> Set up Zeitintervall, Anzahl der Zeitpunkte und die Anzahl der Fokusebenen. Wir verwenden oft 5-10 Sekunden Intervallen und 1-3 Brennebene. </li><li> Wählen Sie ROI und Parameter für die Bildaufnahme, wie oben beschrieben in den Schritten 13-19. </li></ol> Analysieren Movies <ol start="29"><li> Die Daten werden gespeichert, um mit den von Ihnen eingegebenen Namen Ordner und enthalten eine Reihe von TIFF-Dateien für jedes Bild der 4D-Stack, eine Textdatei und eine XML-Datei mit Metadaten wie Exposition und Zeitintervallen werden. </li><li> Die TIFF-Bilder können von ImageJ über zwei Methoden geöffnet werden. Die erste (Methode a) ist die einfachste und lesen Sie auch die Metadaten der einzelnen Dateien. Die zweite (Methode b) ist in der Lage, den virtuellen Speicher verwenden, um Dateien, die größer als die Menge an Speicher zugewiesen ImageJ sind offen, aber es enthält nicht die Metadaten. <ol class="lalpha"><li> Mit Micro-Manager Plugin <ol><li> Micro-Manager ist auf gebaut und verwendet ImageJ (es installiert eine neue Version von ImageJ, die sich von einer anderen Version, die Sie möglicherweise bereits installiert wird) und enthält ein Plugin, um Daten zu öffnen. Alternativ können Sie den Inhalt der Micro-Manager-1.3/plugins Ordner in den Plugin-Ordner kopieren für eine andere Version von ImageJ. </li><li> Zum Plugins-Menü die Option Micro-Manager und dann öffnen Micro-Manager File. </li><li> Wählen Sie den Ordner mit den Daten, die Sie anzeigen möchten, und klicken Sie auf OK. </li><li> Spielen Sie sich durch die Z-und T-Dimensionen. </li></ol></li><li> Mit LOCI plugin, um Filme mit BioFormats Importer öffnen. <ol><li> Übertragen Sie die XML-und txt-Dateien aus dem Ordner mit den tiff-Dateien, und benennen Sie die beiden Dateien, um den Namen des Datensatzes übereinstimmen. </li><li> Innerhalb ImageJ, um die Plugins gehen Pull-Down-Menü wählen Sie LOCI und dann entweder Data Browser oder Bio-Formate Importer. </li><li> Suchen Sie den Ordner mit Ihrem tiff-Stacks. Klicken Sie auf den ersten tiff-Datei, dann öffnen. </li><li> Zeige Stack mit HyperStack. Unter Dataset Organisation: Select Group Dateien mit ähnlichen Namen, Swap Abmessungen und Alle Serien öffnen. Unter Speicher-Management: Wählen Sie: Verwenden virtuellen Stack (vor allem für große Datenmengen). Klicken Sie auf ok </li><li> Das Plugin wird bestimmen die Dimensionen des Datensatzes (Anzahl der Zeitpunkte und Brennebenen) und zeigt den Bereich zwischen einer Reihe von &lt;&gt; Klammern. Klicken Sie auf OK, oder ändern Sie die Anzahl der Zeitpunkte und / oder Fokusebenen zu öffnen. </li><li> Bestätigen Sie die Dimension jeder Serie entspricht. </li><li> Spielen Sie sich durch die Z-und T-Dimensionen. </li></ol></li></ol></li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Stills aus einem Nomarski DIC Film illustriert normalen zellulären Vorgänge während der frühen C. elegans Embryo-Entwicklung: pronukleären Migration (0-5:45), asymmetrische ersten Liga (6.45 bis 14.45 Uhr) und asynchrone Zweitligisten (14:45-27:00). Die Daten wurden mit einem 60x 1,35 NA Objektiv gesammelt. 20 Brennebenen bei 1 Mikrometer Abständen wurden alle 15 Sekunden mit 40 us Exposition gesammelt. Die Bilder wurden so gedreht, dass posterior wird nach rechts und ventral unten ist. Maßstabsbalken repräsentieren 10 Mikron. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Stills aus einem fluoreszierenden Film, der die dynamischen Bewegungen eines GFP-markierten Untereinheit des Chromosoms Passenger Complex (AIR-2) derzeit auf den Chromosomen von Metaphase zu frühen Anaphase (A bis C), bevor sie auf die Spindel Mittelbereich in Anaphase bis Zytokinese vervollständigt (C bis F). Die Daten wurden mit einem 60x 1,35 NA Objektiv gesammelt. Ein einziger Brennebene war alle 10 Sekunden mit 50 us Exposition gesammelt. Die Bilder wurden so gedreht, dass posterior ist auf der rechten Seite. Maßstabsbalken repräsentieren 10 Mikron. Movie 1 Nomarski Film von Wild-Typ Embryo. Film entsprechend 1 Abbildung. Posterior ist nach rechts unten und ventral an der unteren linken Seite. Zeigt einer gemeinsamen Brennebene der ursprünglichen Datenmenge. Das Bild wurde alle 15 Sekunden erfasst und wiedergegeben wird bei 14 Bildern pro Sekunde eingestellt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">Klicken Sie hier, um Video zu sehen</a> Movie 2 Fluorescent Film von Wild-Typ Embryo, die GFP:: AIR-2. Film entsprechend Abbildung 2. Posterior ist an der oberen rechten Seite. Film wurde als Single Brennebene gesammelt. Das Bild wurde alle 10 Sekunden erfasst und wiedergegeben wird bei 14 Bildern pro Sekunde eingestellt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">Klicken Sie hier, um Video zu sehen</a>

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Ein wesentlicher Gesichtspunkt für die Live-Time-Lapse-Bildgebung ist, um die Integrität und die Lebensfähigkeit der Zelle und den Organismus zu erhalten. DIC-Mikroskopie bietet den Vorteil, dass die Probe nicht mit ultraviolettem Licht und eine übermäßige Erwärmung der Lichtquelle ausgesetzt. DIC-Mikroskopie ist gut geeignet, um die Zellwanderung und Zellform Veränderungen wie Zytokinese zu erkennen und einige subzellulären Strukturen wie die mitotische Spindel und Kernmembran zu identifizieren. Fluoreszenz-Imaging von Reporter-Proteine ​​ergänzt DIC-Mikroskopie durch die Identifizierung zusätzlicher subzellulären Kompartimenten und ermöglicht Visualisierung von spezifischen Proteinen. Zur Minderung der Gefahren von Phototoxizität und Schädigung des Embryos während der Fluoreszenz-Imaging, wir üblicherweise die digitale Verstärkung der Kamera, um das reduzierte UV-Licht Intensität und Dauer der Beleuchtung auszugleichen. Für schwache fluoreszierende transgenen Reporter, um Dekonvolutionsalgorithmen zuweisen out-of-focus-Licht oder Schärfungs Algorithmen zur Verringerung der Hintergrund kann die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern. Während Fortgeschrittene Mikroskope wie die konfokale oder Multiphotonen-Systeme manchmal notwendig sind, haben wir festgestellt, dass viele fluoreszierenden Reporter abgebildet werden können mit diesem Mikroskop epifluoreszenten Setup, wodurch Bilder von hoher Qualität sein. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), abgesehen davon, dass freie, speichert Dateien direkt auf TIFF-Format anstelle von proprietären Dateiformaten von vielen kommerziellen Software-Paketen. Das vereinfacht die Analyse unserer Daten durch den Wegfall der Dateikonvertierung Schritt notwendig, um die Bilddateien in ImageJ, Photoshop und anderen Bildbearbeitungsprogrammen gelesen.

Olympus BX61 Mikroskop mit Hamamatsu Orca-ER-Kamera. Plan Fluorit 10x (NA 0,3) und 60x Planachromat (NA 1,35) Objektive Micro-Manager 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) Image J 1,43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose - Molekularbiologie / Gel-Elektrophorese grade Fisher Superfrost / Plus Objektträger (Katalog # 12-550-15) Labor-Band (Fisher Catalog # 15-901 Series) 18 mm x 18 mm # 1.5 Deckgläser M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH 7,3) 25. Vaseline Pinsel / Stick Rasierklingen Heizblock Präpariermikroskop Worms 22 Platindraht holen 22 27G1 / 2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) oder einem Skalpell mit einem kleinen Messer

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

Zelluläre Prozesse, wie Chromosom Montage, Segregation und Zytokinese, sind von Natur aus dynamisch. Zeitraffer-Imaging lebender Zellen mit Fluoreszenz-markierten Reporter-Proteine ​​oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie ermöglicht die Untersuchung des zeitlichen Verlaufs dieser dynamischen Ereignissen, die sonst von der Analyse von festen Proben 1,2 abgeleitet wird. Darüber hinaus erfordert das Studium der Entwicklungs-Vorschriften von zellulären Prozessen Durchführung von Zeitraffer-Experimente an einem intakten Organismus während der Entwicklung. Die Caenorhabiditis elegans Embryo ist lichtdurchlässig und hat eine schnelle, invariant Entwicklungsprogramm mit einem bekannten Zelllinie 3, wodurch eine ideale Experiment Modell zum Studium der Fragen in der Zellbiologie 4,5 und Entwicklung 6-9. C. elegans ist änderbare zur genetischen Manipulation von vorne Genetik (basierend auf Zufallsmutagenese 10,11) und reversen Genetik an spezifische Gene Ziel (basierend auf RNAi-vermittelten Störungen und gezielte Mutagenese 12-15). Darüber hinaus können transgene Tiere leicht geschaffen werden, um Fluoreszenz-markierten Proteine ​​oder Reporter 16,17 auszudrücken. Diese Eigenschaften verbinden, um es einfach um die genetischen Regulierung der grundlegenden zellulären und Entwicklungsprozesse in vivo 18-21 identifizieren. In diesem Protokoll präsentieren wir Methoden für die Live-Darstellung von C elegans Embryonen mit DIC-Optik oder GFP-Fluoreszenz auf eine Verbindung epifluoreszenten Mikroskop. Wir zeigen, mit welcher Leichtigkeit leicht verfügbar Mikroskope, typischerweise für festen Probe Bildgebung verwendet, auch für Zeitraffer-Analyse unter Verwendung von Open-Source-Software, um die Imaging-Prozess automatisieren können angewendet werden.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Die<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryo ist ein leistungsstarkes System zur Untersuchung der Zellbiologie und Entwicklung. Wir präsentieren ein Protokoll für die Live-Darstellung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen nutzen DIC-Optik oder Fluoreszenz mit leicht verfügbaren epifluoreszenten Mikroskope und Open-Source-Software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.8K Aufrufe.  University of Michigan. Die C. elegans Embryo ist ein leistungsstarkes System zur Untersuchung der Zellbiologie und Entwicklung. Wir präsentieren ein Protokoll für die Live-Darstellung von C. elegans Embryonen nutzen DIC-Optik oder Fluoreszenz mit leicht verfügbaren epifluoreszenten Mikroskope und Open-Source-Software.

Serie: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Montage, Tuning und Verwenden eines aperturlosen Near Field Infrared Mikroskop für Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...