내부 기관 자금과 미시간 대학에서 생물 과학 학자 프로그램이 작업을 지원합니다.

웜 준비 <ol><li> 이전 이미지 22 적절한 접시 18 24으로 L4 애벌레 벌레를 전송합니다. 이것은 초기 배아의 충분한 공급 달걀 베어링 성인을 보장합니다. </li><li> 바셀린하고, 아가로 오스의 튜브를 준비합니다. 우리는 전자 레인지에서 비커에 바셀린을 용해하고 관 당 4-5 ML의 나누어지는으로 분배하여 여러 15mL 팰컨 튜브를 준비합니다. 마찬가지로 2-3% (W / V) 버퍼의 아가로 오스 (M9 또는 달걀 버퍼)와 팔콘 튜브로 나누어지는 4-5 ML을 용해. 증발을 최소화하기 위해 초과로 끓여야하지 않도록주의하십시오. 영상의 날, 65-70 ° C 열 블록에 바셀린 1 튜브를 녹으 전자렌지에 아가로 오스 1 튜브를 녹여 다시 끓어 최소화하기 위해주의하십시오. 용융 상태에 바셀린하고, 아가로 오스를 유지하는 열 블록에 튜브를 저장합니다. </li><li> 아가로 오스 패드를 확인합니다. 각 가이​​드 슬라이드의 상단과 하단을 준수 일반적인 실험실 테이프의 단일 층으로 덮여 슬라이드 2 개의 가이드 슬라이드 사이에 새로운 현미경 슬라이드를 놓습니다. 새 슬라이드에 녹아 아가로 오스로부터 2-3 방울을 배치 부러 엔드와 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 원본 슬라이드 2 차 슬라이드 직각와 커버, 그것이 포함하고 얇은 사각형 패드를 만들 수있는 아가로 오스를 확산하는 데 도움이되도록. 2 차 슬라이드 가이드 슬라이드에 테이프 위에 나머지해야합니다. 아가로 오스 농도가 두꺼운 패드 5 %의 증가 수 있습니다. </li><li> 해부 범위와 백금 와이어를 사용하면 18mm X 18mm의 coverslip에 M9이나 에그 버퍼의 9 - 12μL 드롭, 전송이 성인 웜 &quot;을 선택하십시오.&quot; </li><li> 바늘 (우리가 27G1 / 2 바늘을 사용) 또는 배아를 공개 메스와 오픈 웜 컷. 웜 중간에 잘라보십시오. </li><li> 배아를 포함하는 18x18 mm의 coverslip에 아가로 오스 패드 (아래 한천 사이드)를 낮춥니다. 트림 한천​​은 면도날로 커버 슬립의 가장자리에서 확장됩니다. </li><li> coverslip 넷 모두의 가장자리에 녹아 바셀린을 적용하기 위해 페인트 또는 얇은 나무 스틱을 이용하여 인감 Coverslip. </li></ol> (알 껍질이 제대로 형성되지 않는 경우 IE) 배아는 압력에 민감한있다면 달려있어 한천 마운트에 대안은 23 방울. 이미징는 수정이나 감수 분열과 같은 초기 이벤트를 따라 utero에서 수행할 수 있습니다. 웜는 Levamisole 24 anesthetized해야합니다. 개발의 특정 단계에서 배아의 수를 증가하기 위해서는 몇 가지 벌레 한 시간과 부드럽게 피펫 미세 팁 또는 속눈썹 브러쉬를 사용하여 함께 위치 배아 또는 입 pipetting에 의해 해부 수 있습니다. 4D Nomarski DIC (차등 간섭 대비) 영화 <ol start="8"><li> 올림푸스 BX61 현미경을 켜십시오. 카메라가 다른 기기에 의해 방출 EM 파도에 민감하기 때문에 그것은 마지막으로, 수은 전구 (GFP 또는 형광 필요한 경우) 첫째 설정되어 있습니다. 모든가되면 마이크로 관리자를 시작합니다. DIC 또는 형광 이미징에 해당하는 구성 파일을 선택합니다. 주요 차이점은 DIC 파일 형광 셔터 제어를 포함하지 않는다는 것입니다. 각 파일은 해당 필터 큐브 및 카메라 이득 설정을 선택합니다. </li><li> 10X 목표를 사용하여 현미경에서 배아를 찾습니다. 이미징 분야 내에서 여러 배아를 얻기 위해서 젊은 배아의 그룹에 대한 웜기구 근처보세요. 최고의 이미지에 대한 웜 내부 배아를 사용하지 마십시오. </li><li> 목적은 이미징을 위해 (1.4 NA 0.9) 높은 배율 (100x로 40x)와 해상도로 소프트웨어 스위치를 사용합니다. </li><li> ; Nomarski DIC 광학을 (다음 웹 사이트가 도움이 DIC 광학의 설명과 용어를 포함하는 조정 <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha"><li> 우리 올림푸스 BX61에있는 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 <ol><li> 편광판 - 콘덴서 아래의 슬라이더 </li><li> 콘덴서 월라스튼 프리즘 - 터렛 콘덴서에 그냥 무대 아래. </li><li> 대상 월라스튼 프리즘 - 필터 큐브 아래의 슬라이더 </li><li> 2 차 편광판 (분석기) - DIC 위치에 필터 큐브 </li></ol></li><li> 빛의 경로 (소프트웨어 시작이해야)의 분석 (2 차 편광자)를 위치 DIC에 필터 큐브를 전환합니다. </li><li> 두 polarizers가 제대로 (교차) 정렬되었는지 확인합니다. 두 월라스튼 프리즘은 빛을 경로 밖에있는 경우보기의 필드는 어둠해야합니다. 필요한 경우이 정확한지 때까지 콘덴서 아래의 편광을 회전. </li><li> 빛의 경로에 목표 (어퍼) 월라스튼 프리즘을 삽입합니다. </li><li> 당신이 사용하고있는 목표를 일치 월라스튼 프리즘을 선택 콘덴서에 포탑을 회전합니다. </li><li> 렌즈의 NA와 일치하도록이 포탑 아래의 슬라이더를 조정하십시오. </li><li> 최적의 쾰러 조명을위한 콘덴서를 집중. </li><li> 상단 월라스튼 PRI를 조정SM이 슬라이더에있는 손잡이를 회전하여 최적의 콘트라스트를 얻을 수 있습니다. </li><li> 소프트웨어 시작에 의해 제어되는 다른 설정은 카메라의 이득 (0으로 설정)와 8 비트 아니라 16 비트 TIFF 파일로서 저장 파일에 스위치를 포함합니다. </li></ol></li><li> 좋은 이미지를주는 빛의 레벨을 조정합니다. (보통 4.7 볼트를 사용하는 () 소프트웨어를 통해 제어). 우리는 가장 밝은 픽셀 그냥 포화 수준 이하 있도록 예제를 조명하는 것을 선호합니다. 배아의 노른자의 과립이 명확하게 눈에 띄는 3 차원 얼굴로 이미지에 좋은 DIC 광학 결과입니다. 예제를 조명 빛이 시료의 한쪽 (또는 표본의 기능)이 밝은 조명과 반대편은 그림자에 있으며 어두운 표시되도록 각도에서 빛나는하는 것으로 판단되는 경우 등 또는이 설명하실 수 있습니다. </li><li> 이 이미지에 원하는 배아를 포함하는이자 (ROI)의 지역을 선택하고, 창문을 줄이기 위해 투자 수익 (ROI) 버튼을 설정을 누릅니다. </li><li> 다차원 수집 창을 엽니다. Z - 스택 (조각)과 시간 포인트를 선택합니다. </li><li> 배아의 하단 (초점의 일부 노른자의 과립 지난 초점 비행기)를 찾기 위해 현미경의 초점 노브를 사용하십시오. 선택 아래를 클릭하십시오. 배아의 정상을 확인하고 설정하는 반복합니다. 우리는 일반적으로 하나 마이크론 단계 크기를 사용하고 ~ 20 초점 비행기와 끝. 배아 및 세포가 상대적으로 두께가 있기 때문에 우리는 일반적으로 각각의 시점에서 여러 개의 초점 비행기를 수집합니다. 또한 세포가 서로 다른 방향으로 나누어 시작 특히 그들은 원래 초점 비행기 그들을 또는 밖으로 이동 배아에서 주변의 다른 세포를 치환 수 있습니다. 당신의 현미경이 초점 모터가없는 경우에는 수동으로 관심있는 셀 또는 프로세스를 따르도록 초점을 조정할 수 있습니다. </li><li> 시간 지점과 시간 간격의 입력 번호가 필요합니다. 우리는 일반적으로 15초 간격을 사용하여 500 시간 포인트의 최대를 설정합니다. 원하는 때 우리가 인수를 필요로하고 중단 없을 정도로 우리는 더 많은 시간을 포인트로 시작합니다. 당신은 이미지 여러 초점 비행기있다면, 시간이 지점 사이의 간격에 초점 비행기의를 얻기위한 시간이 충분한지 확인하십시오. </li><li> 데이터를 저장할 위치를 선택하거나 만듭니다. 소프트웨어에만 마지막으로 이미지를 표시하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 파일 이름을주고 취득을 클릭합니다. 제대로 작동하기 위해 처음 몇 시간 지점에 대한 자동 이미지 수집을 모니터링합니다. </li><li> 이 인수를 중지하려는 경우 중지를 클릭, 10X 목표로 전환하여 다음 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 완료되면 영상이 빛을 경로에서 DIC 구성 요소를 제거합니다. 객관적 필요한 경우 해제 깨끗한 기름. 카메라와 함께 시작을 모두 켭니다. </li></ol> GFP 영화 <ol start="20"><li> 현미경을 시작하고 위의 배아를 찾으십시오. 형광 셔터의 소프트웨어 제어를 포함 구성 파일을 사용합니다. </li><li> 상단 DIC 프리즘 (슬라이더가) 빛 경로에 있지 않은지 확인합니다. </li><li> FITC / GFP에 필터 큐브를 (자동으로 시작시 설정) 스위치 </li><li> 16 비트 TIFF (자동으로이 구성 파일과 함께 시작에서 설정)에 255 카메라 게인 및 이미지 파일을 변경합니다. </li><li> 하얀 빛을 끄십시오. </li><li> 미리보기 이미지 영상 라이브 클릭하십시오. 빛의 노출을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 또는 단일 이미지를 수집하는 스냅 이미지를 사용합니다. </li><li> 수은 전구 전원 / 중성 농도 필터, 좋은 이미지를 얻을 노출 길이를 조정합니다. 일반적으로, 당신은 형광 신호의 셀을 클릭하고 photobleaching에 photodamage을 줄이기 위해 원하는 데이터를 얻기위한 샘플을 도달 최소 조명을 사용해야합니다. </li><li> 시간 간격, 시간 포인트의 번호와 초점 비행기의 개수를 설정합니다. 우리는 종종 50~10초 간격과 1-3 초점 비행기를 사용합니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)을 선택하고 이전 단계 13-19에 설명된대로 이미지 수집을위한 매개 변수를 설정합니다. </li></ol> 분석 영화 <ol start="29"><li> 데이터는 사용자가 입력한 이름으로 폴더와 4D 스택의 각 이미지를 TIFF 파일의 일련의 텍스트 파일과 노출 수준 및 시간 간격과 같은 XML 파일이 포함된 메타 데이터를 포함에 저장됩니다. </li><li> TIFF 이미지는 두 가지 방법을 통해 ImageJ으로 열 수 있습니다. (방법) 첫 번째는 가장 간단한이며, 또한 각 파일의 메타 데이터를 읽습니다. (방법 B) 두 번째 ImageJ에 할당된 메모리의 양을보다 큰 파일을 열려면 가상 메모리를 사용할 수 있지만, 그것은 메타 데이터를 포함하지 않습니다. <ol class="lalpha"><li> 마이크로 관리자 플러그인을 사용하여 <ol><li> 마이크로 관리자에 구축하고 사용 ImageJ를 (이것은 당신이 이전에 설치된 수도 있습니다 그 밖의 다른 버전과 다를 수 있습니다 ImageJ의 새 버전을 설치) 및 데이터를 열 수있는 플러그인을 포함하고 있습니다. 또는 당신은 ImageJ의 다른 버전에 대한 플러그인 폴더로 Micro-Manager-1.3/plugins 폴더의 내용을 복사할 수 있습니다. </li><li> , 플러그인 메뉴로 이동 마이크로 관리자를 선택한 다음 열기를 마이크로 관리자 파일입니다. </li><li> 당신이 확인하고 확인을 클릭하여 원하는 데이터를 포함하는 폴더를 선택합니다. </li><li> Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다. </li></ol></li><li> LOCI plugi를 사용하여BioFormats 가져오기와 함께 영화를 엽니다 N. <ol><li> TIFF 파일이 들어있는 폴더에서 XML과 TXT 파일을 전송하고, 데이터 집합의 이름과 일치하는 두 파일의 이름을 바꿉니다. </li><li> ImageJ 내에서, 데이터 브라우저 또는 바이오 형식 수입 중 다음 플러그인으로 이동 풀다운 메뉴를, LOCI을 선택합니다. </li><li> 귀하의 티파니 스택이있는 폴더를 찾습니다. 첫 번째 TIFF 파일을 클릭한 다음 엽니다. </li><li> Hyperstack와 스택을 볼 수 있습니다. 데이터 집합 조직에서 유사 이름, 스왑 크기와 그룹 파일을 선택하고 모든 시리즈를 엽니다. 메모리 관리에서 선택 (특히 대용량 데이터 집합에 대한) 가상 스택을 사용합니다. 확인을 클릭합니다 </li><li> 플러그인 설정 데이터의 크기를 (# 시간 지점과 초점 비행기의) 확인하고 &lt;&gt; 괄호 집합 사이의 범위를 표시합니다. 확인을 클릭하거나 시간 지점 및 / 또는 열 초점 비행기의 수를 변경할 수 있습니다. </li><li> 치수는 각 시리즈에 해당하는 확인합니다. </li><li> Z와 T 치수를 통해 재생할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="그림 1" /> Nomarski DIC 영화에서 그림 1. 스틸스 일찍 C. 동안 정상적인 세포 이벤트를 설명하는 엘레간스의 배아 개발 : pronuclear 마이 그 레이션 (0-5:45), 비대칭 1 부 (6시 45분부터 14시 45분까지)와 비동기 2 부 (14:45-27:00). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나 마이크론 간격 20 초점 비행기는 40 μs 노출과 함께 15 초마다를 수집했다. 그 뒷부분의 오른쪽 복부 아래입니다하므로 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. metaphase에서 초기 anaphase (A C)를 anaphase에서 스핀들 midzone에 게재되기 전에까지하는 염색체에 존재하는 염색체 여객 복합 GFP - 라벨 subunit (AIR - 2)의 역동적인 움직임을 설명하는 형광 영화에서 스틸 cytokinesis 완료 (F로 C). 데이터는 60x 1.35 NA 렌즈로 수집했다. 하나의 초점 평면은 50 μsec 노출 10 초마다를 수집했다. 그 뒷부분이 오른쪽으로되도록 이미지 회전했다. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다. 와일드 타입 배의 영화 한 Nomarski 영화. 그림 1에 해당하는 영화. 뒷부분이 오른쪽 복부 아래로 것은 왼쪽 하단입니다. 설정 원본 데이터의 단일 초점 비행기를 표시합니다. 이미지가 매 15 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> GFP를 표현 야생 형 배아의 영화 두 형광등 영화 : AIR - 2. 그림 2에 해당하는 영화. 뒷부분은 오른쪽 상단에 있습니다. 영화는 하나의 초점 비행기로 수집했다. 이미지가 매 10 초 수집되어 재생이 다시 초당 14 프레임으로 설정 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

라이브 시간 저속 영상을위한 주요 고려 사항은 세포와 유기체의 무결성과 생존을 보존하는 것입니다. DIC 현미경은 시료가 조명 소스에서 자외선 및 과도한 가열에 노출되지이라는 이점을 제공합니다. DIC 현미경은 세포를 마이 그 레이션과 같은 cytokinesis 같은 세포 모양의 변화를 감지하고 같은 mitotic 스핀들과 핵 막 같은 subcellular 구조를 식별하는 데 적합합니다. 기자 단백질의 형광 이미징 추가 subcellular 구획을 식별하고 특정 단백질의 시각화를함으로써 DIC 현미경을 보완합니다. phototoxicity 및 형광 이미징 동안 배아 손상의 위험을 완화하기 위해, 우리는 보통 감소 UV 조명 강도 및 조명 기간을 상쇄하기 위해 카메라의 디지털 게인을 향상시킬 수 있습니다. 희미한 형광 유전자 변형 기자 들면, deconvolution 알고리즘은 배경이 촬영된 이미지의 품질을 향상시킬 수 감소 밖의 포커스 라이트 또는 deblurring 알고리즘을 할당합니다. 이러한 공촛점 또는 multiphoton 시스템과 같은 고급 현미경 가끔 필요하지만, 우리는 많은 형광 기자가 고품질의 이미지를 항복이 epifluorescent 현미경 설정을 사용하여 몇 군데 수있는 것으로 나타났습니다. 마이크로 관리자 (http://www.micro-manager.org)은 무료로되고 이외에 직접 TIFF 형식으로 파일을 대신 많은 상용 소프트웨어 패키지의 독점 파일 형식을 저장합니다. 이것은 크게 ImageJ, 포토샵 및 기타 이미지 편집 소프트웨어에서 이미지 파일을 읽는 데 필요한 파일 변환 단계를 제거함으로써 데이터의 분석을 간소화합니다.

하마 마츠 오카 - ER 카메라와 올림푸스 BX61 현미경. 10X 계획 형석 (NA 0.3) 및 60x PlanAchromat (NA 1.35) 객관 렌즈 마이크로 관리자 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) 이미지 J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) 아가로 오스 - 분자 생물학 / 겔 전기 영동 등급 피셔 Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 (카탈로그 # 12-550-15) 연구실 테이프 (피셔 카탈로그 # 15-901 시리즈) 18mm X 18mm # 1.5 Coverslips M9 (242 MM KH 2 PO 4, 40 MM 나 2 HPO 4, 9 밀리 g NaCl, 19 MM NH 4 Club 호텔 MgSO 4) (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). 에그 버퍼 (118 MM NaCl, 48 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 25 MM HEPES, pH를 7.3) 25. 바셀린 브러쉬 / 스틱 면도날 열 블록 해부 현미경 웜 22 플래티넘 와이어 22을 선택 27G1 / 2 정밀 글라이드 니들 (베크턴 디킨슨) 또는 작은 블레이드와 메스

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

이러한 염색체 조립, 분리 및 cytokinesis로 휴대 프로세스는, 본질적으로 동적입니다. 형광 - 표시 기자 단백질 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 시간 저속 영상은, 그렇지 않으면 고정 샘플 1,2 분석에서 유추됩니다 이러한 동적 이벤트의 시간적 진행의 시험을 수 있습니다. 또한, 세포 프로세스의 개발 규제의 연구 개발 기간 동안 손상 유기체에서 시간 경과 실험을 실시하고 필요로. Caenorhabiditis 엘레간스 배아 따라서 4,5 및 개발 6-9 세포 생물학 질문을 공부에 이상적인 실험 모델을 제공 빛을 투명 3 혈통 알려진 세포와 빠른, 불변량 발달 프로그램을하고 있습니다. C.가 엘레간스 앞으로 유전학 (무작위 돌연변이 유발 10,11 기준)과 특정 유전자를 대상으로 역방향 유전학 (RNAi - 중재 간섭에 기초하고 돌연변이 유발 12-15 타겟)에 의해 유전자 조작을 수정할 수있는 것입니다. 또한, 유전자 변형 동물은 쉽게 찬란 태그 단백질이나 기자 16,17 표현을 만들 수 있습니다. 이러한 특징은 쉽게 생체내 18-21의 근본적인 세포 발달 과정을 조절 유전자 경로를 식별할 수 있도록 결합되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 C. 라이브 이미징을위한 방법을 제시 복합 epifluorescent 현미경의 DIC 광학 또는 GFP의 형광을 사용하여 엘레간스의 배아. 우리는 일반적으로 고정 샘플 이미징에 사용되는 즉시 사용할 수 현미경은, 또한 이미징 프로세스를 자동화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용 시간 저속 분석을 위해 적용할 수있는 쉽게 보여줍니다.

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 배아는 세포 생물학과 발전을 연구위한 강력한 시스템입니다. 우리는 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 쉽게 사용할 수 epifluorescent 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용 DIC 광학 또는 형광을 이용하여 배아.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.7K 조회수.  University of Michigan.  C. 엘레간스 배아는 세포 생물학과 발전을 연구위한 강력한 시스템입니다. 우리는 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시 C. 엘레간스 쉽게 사용할 수 epifluorescent 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용 DIC 광학 또는 형광을 이용하여 배아.

비디오: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 Apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

이미징 C. 엘레간스 태아