כספים מוסדיים פנימיים למדעי חוקרים ביולוגיים תוכנית באוניברסיטת מישיגן נתמך העבודה הזאת.

תולעת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת L4 תולעים הזחל אל צלחות המתאים 18-24hrs לפני הדמיה 22. זה יבטיח לך ביצה נושאות מבוגרים לאספקת שפע של עוברי מוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות וזלין, agarose. אנחנו מכינים כמה צינורות 15ml בז ידי התכה וזלין בכוס במיקרוגל מחלק לתוך aliquot 4-5 מ&quot;ל לכל צינור. בדומה להמיס 2-3% (w / v) agarose ב הצפת (M9 או ביצה הצפת) ו aliquot 4-5 מ&quot;ל לתוך צינורות בז. להיזהר לא להרתיח את עודף על מנת לצמצם התאדות. ביום של הדמיה, להמיס 1 שפופרת של וזלין בתוך בלוק 65-70 מעלות צלזיוס חום להמיס 1 שפופרת של agarose במיקרוגל, שוב להיזהר כדי למזער רותחים. חנות צינורות לחסום את חום כדי לשמור על וזלין ואת agarose במצב מותך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את agarose כרית. מיקום שקופיות מיקרוסקופ חדש בין 2 שקופיות מדריך, אשר שקופיות מכוסה בשכבה אחת של סרט מעבדה משותפת דבק העליון והתחתון של כל שקופית מדריך. השתמש פיפטה פסטר עם סוף נשבר למקום 2-3 טיפות agarose נמס בשקופית חדשה. מכסים הניצב 2 nd שקופית לשקופית המקורית, כך שהוא מכסה ועוזר להפיץ את agarose כדי ליצור משטח מרובע דק. השקופית 2 nd צריך לנוח מעל הקלטת בשקופיות מדריך. ריכוז agarose ניתן להעלות ל -5% עבור פדים עבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש היקף הניתוח, חוט פלטינה &quot;להרים&quot;, להעביר 2 תולעים בוגרות לירידה 9-12μL של הצפת M9 או ביצה על 18 x 18 מ&quot;מ coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור תולעים לפתוח עם מחט (נשתמש 27G1 / 2 מחטים) או אזמל לשחרר עוברים. נסו לחתוך באמצע של התולעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון agarose כרית (עם הצד אגר למטה) על coverslip 18x18 מ&quot;מ המכילים את העוברים. אגר חתוך הארכת מקצה להחליק את המכסה עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם coverslip באמצעות מכחול או מקל עץ דק ליישם את וזלין נמס אל כל ארבעת הקצוות של coverslip. </li></ol> חלופיות mounts אגר תלויות טיפות 23 אם עוברים רגישים ללחץ (כלומר, אם פגז ביצה לא טופס כמו שצריך). הדמיה יכולה גם להתבצע ברחם לעקוב אחרי הפריה או אירועים מוקדם כגון המיוזה. תולעים צריך להיות מורדם עם Levamisole 24. על מנת להגדיל את מספר העוברים משלב מסוים של התפתחות, תולעים כמה יכול להיות גזור בבת אחת ואת מיקומו עוברים יחד בעדינות בעזרת קצה עדין פיפטה או מברשת ריסים או pipetting הפה. 4D Nomarski DIC (הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות) סרטים <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ אולימפוס BX61. כי המצלמה היא רגישה EM גלים הנפלטים על ידי מכשירים אחרים הוא דולק האחרון, נורת כספית (במידת הצורך עבור GFP או פלואורסצנטי) הראשון. התחל Micro-מנהל פעם הכל על. בחר את קובץ ההגדרות המתאים הדמיה DIC או פלורסנט. ההבדל העיקרי הוא כי תיק DIC אינו כולל שליטה על הצמצם ניאון. כל קובץ גם בוחר את הקוביה הסינון המתאים ולהשיג הגדרת מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את העוברים על מיקרוסקופ באמצעות המטרה 10x. תראו ליד גופות תולעת לקבוצות של צעירים עוברים על מנת לקבל עוברים מרובים בתחום ההדמיה. הימנע עוברים בתוך התולעת הטובה ביותר עבור תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מתג התוכנה הגדלה גבוהה (40X כדי 100x) ורזולוציה (NA 0.9-1.4) המטרה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם Nomarski DIC אופטיקה (באתרי האינטרנט הבאים מכילים הסבר מועיל האופטיקה DIC ואת המינוח; <a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום BX61 אולימפוס שלנו המרכיבים החשובים הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקטב - המחוון למטה הקבל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Condenser פריזמה וולאסטון - הצריח על הקבל, ממש מתחת לבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריזמה המטרה וולאסטון - המחוון מתחת קוביות מסנן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 nd מקטב (Analyzer) - קוביה המסנן במצב DIC </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Cube מסנן DIC לתפקיד Analyzer (2 nd מקטב) בנתיב האור (תוכנה צריכים לעשות את זה על סטארט אפ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי שני מקטבים מיושרים כראוי (חצה). כאשר הן מנסרות וולאסטון מחוץ נתיב האור את שדה הראיה צריך להיות כהה. אם יש צורך, לסובב את מקטב להלן הקבל עד זה נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את (העליון) המטרה וולאסטון פריזמה לתוך נתיב האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הצריח על הקבל כדי לבחור את פריזמה וולאסטון התואמת את המטרה אתה משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המחוון מתחת לצריח זה כדי להתאים NA של העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס הקבל לתאורה קוהלר אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם העליון וולאסטון פריsm לקבל בניגוד אופטימלית על ידי סיבוב הידית על המחוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות אחרות שבשליטת ההפעלה תוכנה כוללים רווח המצלמה (מוגדר 0) ולעבור שמירת קבצים כמו 8-bit 16-bit לא קבצי TIFF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את רמת האור לתת תמונה יפה. (בדרך כלל להשתמש 4.7 וולט) (נשלט באמצעות תוכנה). אנחנו מעדיפים כדי להאיר את המדגם כך הפיקסלים הבהירים הם רק מתחת לרמות הרוויה. טוב אופטיקה תוצאות DIC בתמונה עם מבט 3 מימדי שבו גרגרי חלמון בעובר להתבלט בבירור. לחילופין זה יכול להיות מתואר כאילו האור המאיר את המדגם נראה להאיר מזווית כך צד אחד של המדגם (או תכונות במדגם) הוא המואר והצד השני הוא הצללים מופיע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור עניין (ROI) כדי לכלול את העוברים אתה רוצה תמונה, לחץ על כפתור לקבוע את ההחזר על ההשקעה להפחית החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלון רב מימדי הרכישה. בחר Z-ערימות (פרוסות) ונקודות זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש להתמקד ידית מיקרוסקופ כדי למצוא את החלק התחתון של העובר (מישור המוקד האחרון עם כמה גרגרי חלמון בפוקוס). לחץ בתחתית בחר. חזור לזהות ולהגדיר את החלק העליון של העובר. בדרך כלל אנו משתמשים 1 צעד בגודל מיקרון בסופו של דבר עם ~ 20 מטוסים מוקד. בדרך כלל אנחנו אוספים מטוסים מוקד מרובים בכל נקודת זמן כי עוברים ותאי עבים יחסית. בנוסף במיוחד כאשר התאים מתחילים להתחלק ב נטיות שונות הם יכולים לעקור תאים אחרים סביב העובר להעביר אותם או הקטנה של המטוס המוקד המקורי. אם מיקרוסקופ שלך אין מנוע פוקוס ידני אתה יכול להתאים את המוקד פעל התא או תהליך אתם מעוניינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר קלט של נקודות זמן במרווח הזמן הדרוש. אנחנו בדרך כלל להשתמש במרווח 15 שניות וקבע מקסימום של 500 נקודות הזמן. אנחנו מתחילים עם נקודות יותר זמן נצטרך לעצור את הרכישה בעת הצורך. אם אתה מרובים הדמיה מטוסים מוקד, יש לוודא שיש מספיק זמן כדי לרכוש את כל המטוסים מוקד מרווח בין נקודות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר או ליצור מיקום לשמירת נתונים. ודא כי התוכנה מוגדרת להצגת התמונה האחרונה בלבד. תן לקובץ שם ולחץ רוכשת. צג רכישת תמונה אוטומטית את הנקודות לראשונה כמה כדי להבטיח שהוא פועל כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ להפסיק מתי שאתה רוצה להפסיק את הרכישה, עבור מטרה 10x ולהכין את השקופית הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום הדמיה להסיר רכיבים DIC מנתיב האור. שמן נקי את המטרה במידת הצורך. הפעל את הכל החל עם המצלמה. </li></ol> GFP סרטים <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מיקרוסקופ ולמצוא עוברים לעיל. השתמש קובץ התצורה הכוללת תוכנת שליטה של ​​תריס ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי פריזמה DIC העליון (המחוון) אינו בנתיב האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Cube מסנן FITC / GFP (מוגדר באופן אוטומטי באתחול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה להשיג מצלמה עד 255 ו קובץ תמונה 16-bit Tiff (מוגדר באופן אוטומטי באתחול עם קובץ התצורה הזו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור הלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ חי הדמיה תמונת התצוגה המקדימה. עבודה במהירות כדי לצמצם את החשיפה לאור. לחילופין להשתמש תמונה הצמד לאסוף תמונה בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת כוח מרקורי הנורה / מסננים צפיפות ניטרלי, אורך חשיפה כדי לקבל תמונה טובה. באופן כללי, כדאי להשתמש באור מינימום להגיע מדגם לרכוש את הנתונים שברצונך לצמצם נזקי לצינוק photobleaching של אותות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מרווח זמן, מספר נקודות זמן של מספר מטוסים מוקד. אנו מרבים להשתמש במרווחים second 5-10 והמטוס מוקד 1-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ROI ולהגדיר פרמטרים לרכישת התמונה כמתואר לעיל שלבים 13-19. </li></ol> ניתוח סרטים <ol start="29" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים יישמרו בתיקיה עם השם שהזנת מכילים סדרה של קבצי tiff עבור כל תמונה של מחסנית 4D, קובץ טקסט ו metadata קובץ XML המכיל כגון רמות החשיפה במרווחי זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות TIFF ניתן לפתוח על ידי ImageJ באמצעות שתי שיטות. הראשון (שיטה) היא הפשוטה גם לקרוא את metadata של כל קובץ. השני (שיטה ב) הוא מסוגל להשתמש בזיכרון וירטואלי כדי לפתוח קבצים שגודלם עולה על כמות הזיכרון המוקצה ImageJ, אבל זה אינו כולל את metadata. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרו-מנהל Plugin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-מנהל בנויה על ומשתמש ImageJ (היא מתקינה גירסה חדשה של ImageJ אשר יהיה שונה מכל גירסה אחרת ייתכן שהתקנת בעבר) והוא כולל תוסף כדי לפתוח נתונים. לחילופין אתה יכול להעתיק את תוכן התיקייה Micro-Manager-1.3/plugins לתיקיית plugins עבור גרסה אחרת של ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכו לתפריט תוספים, בחר Micro-מנהל ואז מנהל קבצים Micro-Open. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התיקייה המכילה את הנתונים שברצונך להציג ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחק דרך הממדים Z ו-T. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש לוקוסים plugin כדי לפתוח סרטים עם יבואן BioFormats. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת קבצי XML ו-txt מתוך התיקיה המכילה את קבצי TIFF, ושנה את שני הקבצים כדי להתאים את השם של ערכת הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך ImageJ, עבור תוספים לנתץ התפריט, בחר לוקוסים ולאחר מכן דפדפן נתונים או ביו פורמטים יבואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התיקייה עם ערימות tiff שלך. לחץ על קובץ TIFF הראשון, ולאחר מכן לפתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה מחסנית עם Hyperstack. תחת ארגון במערך: בחר קבצים קבוצה עם ממדים שמות דומים, Swap ולפתוח את כל הסדרה. תחת ניהולו זיכרון: בחר: השתמש מחסנית וירטואלית (במיוחד עבור ערכות נתונים גדולות). לחץ על אישור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוסף תקבע את הממדים של הנתונים להגדיר (# של נקודות זמן ומטוסים מוקד) ולהציג את הטווח בין קבוצה של &lt;&gt; בסוגריים. לחץ על אישור או לשנות את מספר נקודות זמן ו / או מטוסים מוקד לפתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר בה מימד מקביל כל סדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחק דרך הממדים Z ו-T. </li></ol></li></ol></li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סטילס מסרט Nomarski DIC הממחישות אירועים הסלולר נורמלי במהלך C. מוקדם elegans התפתחות העובר: הגירה pronuclear (0-5:45), הדיוויזיה הראשונה אסימטרי (6:45-14:45) ואת הליגה השניה אסינכרוני (14:45-27:00). הנתונים נאספו עם עדשה 60x NA 1.35. 20 מטוסים מוקד ב 1 במרווחים מיקרון נאספו כל 15 שניות עם חשיפה μs 40. תמונות היו מסובבים כך האחורי כלומר הזכות הגחון הוא למטה. בר קנה מידה מייצגים 10 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סטילס מסרט פלורסנט הממחישות את תנועות דינמיות של למקטע GFP שכותרתו של מורכבות הנוסע כרומוזום (AIR-2) ההווה על הכרומוזומים מפני metaphase כדי anaphase מוקדם (A ל-C) לפני המופיעים midzone ציר ב anaphase עד cytokinesis משלים (C ל-F). הנתונים נאספו עם עדשה 60x NA 1.35. מטוס מוקד יחיד נאסף כל 10 שניות עם חשיפה μsec 50. תמונות היו מסובבים כך האחורי כלומר ימינה. בר קנה מידה מייצגים 10 מיקרון. סרט 1 סרט Nomarski של העובר wild-type. סרט המתאים באיור 1. Posterior הוא לתחתית ימין הגחון היא השמאלית התחתונה. הופעות מטוס מוקד יחיד של הנתונים המקוריים שנקבעו. תמונה נאסף כל 15 שניות ולהשמיע מוגדר 14 מסגרות לשנייה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a> 2 סרט סרט פלורסנט של העובר wild-type GFP לבטא: AIR-2. המתאים איור 2 סרט. Posterior היא הימנית העליונה. סרט נאסף כמו מטוס מוקד יחיד. תמונה נאסף כל 10 שניות ולהשמיע מוגדר 14 מסגרות לשנייה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a>

<ol>
	<li>Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+a+stable+cohesin-chromatin+interaction+after+but+not+before+DNA+replication.">Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication.</a> Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).</li><li>Nabeshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Heuvel, S. v. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+regulation.">Cell-cycle regulation.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Gonczy, P., Rose, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division+and+axis+formation+in+the+embryo.">Asymmetric cell division and axis formation in the embryo.</a> WormBook. , 1-20 (2005).</li><li>Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+C.+elegans.">Gastrulation in C. elegans.</a> WormBook. , 1-13 (2005).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+temperature-sensitive+cell-division+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 149, 1303-1321 (1998).</li><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans+[see+comments].">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments].</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+by+chemical+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 17, 119-121 (1997).</li><li>Liu, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+Caenorhabditis+elegans+deletion+mutants.">High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants.</a> Genome Res. 9, 859-867 (1999).</li><li>Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NemaGENETAG+initiative:+large+scale+transposon+insertion+gene-tagging+in+Caenorhabditis+elegans.">The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 137, 39-46 (2009).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+genes+expressed+in+the+ovary+of+Caenorhabditis+elegans.">RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).</li><li>Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III.">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408, 331-336 (2000).</li><li>Sonnichsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-genome+RNAi+profiling+of+early+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 434, 462-469 (2005).</li><li>Mohler, W. A., Isaacson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Bembenek, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+granule+exocytosis+in+C.+elegans+is+regulated+by+cell+cycle+components+including+separase.">Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase.</a> Development. 134, 3837-3848 (2007).</li><li>Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+actin+cytoskeleton+and+homotypic+membrane+fusion+in+ER+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans.">Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).</li><li>Bianchi, L., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+embryonic+C.+elegans+cells+for+electrophysiological+and+pharmacological+analyses.">Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses.</a> WormBook. , 1-15 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיקול מרכזי עבור דימות זמן לשגות לחיות היא לשמר את היושרה ואת הכדאיות של התא ושל האורגניזם. מיקרוסקופיה DIC מספק את היתרון כי המדגם אינו נחשף לאור אולטרה סגול וחימום יתר ממקור תאורה. מיקרוסקופיה DIC הוא גם מתאים כדי לזהות נדידת תאים וצורתם תא שינויים כגון cytokinesis כדי לזהות כמה מבנים subcellular, כגון ציר mitotic ואת קרום הגרעין. דימות פלואורסצנטי של חלבונים כתב משלים מיקרוסקופיה DIC ידי זיהוי תאים subcellular נוסף המאפשר הדמיה של חלבונים מסוימים. כדי להקטין את הסכנות של phototoxicity ופגיעה בעובר במהלך דימות פלואורסצנטי, אנחנו בדרך כלל להגדיל את הרווח דיגיטלי של המצלמה כדי לקזז את UV מופחת אור בעוצמה ומשך התאורה. עבור קלוש כתבים מהונדס פלורסנט, אלגוריתמים deconvolution כדי להקצות מחדש מחוץ להתמקד אלגוריתמים אור או deblurring להפחית רקע יכול לשפר את האיכות של התמונות שנתפסו. בעוד מיקרוסקופים מתקדמים, כגון מערכות confocal או multiphoton הם לפעמים יש צורך, מצאנו כי הכתבים ניאון רבים ניתן הדמיה באמצעות התקנה זו מיקרוסקופ epifluorescent, מניב תמונות באיכות גבוהה. Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), בנוסף להיותו חינם, שומר קבצים ישירות בפורמט TIFF במקום פורמטים של קבצים קניינית של הרבה חבילות תוכנה מסחריות. זו משמעותית מפשט את ניתוח הנתונים שלנו על ידי ביטול המרת קובץ הצעד הדרוש כדי לקרוא את קבצי התמונה ImageJ, Photoshop ו תוכנה אחרת לעריכת תמונות.

אולימפוס BX61 מיקרוסקופ עם מצלמה אורקה-ER Hamamatsu. תוכנית פלואוריט 10x (NA 0.3) ו PlanAchromat 60x (NA 1.35) עדשות אובייקטיבי Micro-מנהל 1.3.46 (http://www.micro-manager.org) תמונה J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij) loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu) Agarose - ביולוגיה מולקולרית / ג&#39;ל אלקטרופורזה כיתה פישר Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות (קטלוג # 12-550-15) מעבדה קלטת (פישר קטלוג # 15-901 סדרה) 18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ # 1.5 Coverslips M9 (242 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na 2 HPO 4, 9 מ&quot;מ גרם NaCl, 19 מ&quot;מ NH 4 Cl MgSO 4) (Http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). ביצה חוצץ (118 mM NaCl, KCl 48 mM, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 25 HEPES מ&quot;מ, pH 7.3) 25. וזלין מברשת / Stick סכיני גילוח מחממים לחסום הביתור מיקרוסקופ תולעים 22 חוט פלטינה לאסוף 22 27G1 / 2 Precision Glide מחט (Beckton דיקינסון) או אזמל עם להב קטן

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

תהליכים תאיים, כגון הפרדה הרכבה, כרומוזום ו cytokinesis, הם דינמיים מטבעם. זמן לשגות הדמיה של תאים חיים, באמצעות ניאון שכותרתו חלבונים הכתב או הפרעה ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה, מאפשר בחינה של התקדמות הזמני של האירועים הללו דינמי אשר להסיק אחרת מניתוח של 1,2 דגימות קבוע. יתרה מכך, המחקר של תקנות התפתחותיים של תהליכים תאיים מחייבת ניהול זמן לשגות ניסויים על אורגניזם שלם במהלך הפיתוח. העובר elegans Caenorhabiditis אור שקוף יש תוכנית מהירה, התפתחותי משתנה עם תא ידוע שושלת 3, ובכך לספק מודל ניסוי אידיאלי לבחינת שאלות בביולוגיה של התא 4,5 ופיתוח 6-9. ג elegans היא amendable כדי מניפולציה גנטית על ידי קדימה גנטיקה (מבוסס על mutagenesis אקראי 10,11) גנטיקה הפוכה למקד גנים ספציפיים (מבוסס על הפרעה RNAi בתיווך ממוקד mutagenesis 12-15). בנוסף, חיות טרנסגניות ניתן ליצור בקלות להביע את החלבונים המתויגים fluorescently או כתבים 16,17. תכונות אלה משלבים כדי שיהיה קל לזהות את המסלולים הגנטיים בוויסות תהליכים תאיים והתפתחותית היסוד in vivo 18-21. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטות הדמיה חיה של C. עוברים elegans באמצעות אופטיקה DIC או פלואורסצנטי GFP על מיקרוסקופ epifluorescent המתחם. אנו מדגימים את הקלות שבה מיקרוסקופים זמינים, משמש בדרך כלל הדמיה מדגם קבוע, יכול להיות מיושם גם לניתוח זמן לשגות באמצעות תוכנות קוד פתוח כדי למכן את תהליך ההדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software at JoVE.com

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

<em&gt; ג elegans</emהעובר&gt; היא מערכת רבת עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ופיתוח. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים ניצול אופטיקה DIC או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescent זמינים מקור פתוח תוכנה.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

imaging-c-elegans-embryos-using-an-epifluorescent-microscope-open

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.8K Views.  University of Michigan.  ג elegans היא מערכת רבת עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ופיתוח. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של ג elegans עוברים ניצול אופטיקה DIC או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescent זמינים מקור פתוח תוכנה.

Video: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

העצרת, כוונון ושימוש מיקרוסקופ שדה Apertureless קרוב אינפרא אדום עבור הדמיה חלבון

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...