Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como cómo los patógenos bacterianos causan enfermedades en los seres humanos mediante la utilización de proteínas humanas. La principal ventaja de esta técnica es que puede responder si cualquier patógeno puede utilizar Vitronectin para establecer la infección del huésped. Nos centraremos en Vitronectin, una proteína huésped que participa en la matriz extracelular, pero también funciona como un inhibidor del complemento en la vía determinante de activación del complemento.
Estos hechos son muy importantes y muy atractivos para los patógenos que causan enfermedades en los seres humanos. Para prepararse para la citometría de flujo, resuspender los gránulos bacterianos con 50 microlitros de tampón de bloqueo que contiene 250 nanomolar Vitronectin. Luego, incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente sin agitar.
Después de la incubación, peletizar la bacteria por centrifugación a 3,500 g durante cinco minutos. Luego, lave los pellets tres veces usando PBS y pasos similares de centrifugación. Después del lavado, añadir 50 microlitros de anticuerpos policlonales antihumanos primarios de oveja Vitronectin al pellet bacteriano en una dilución de uno a 100 en PBS BSA.
Incubar la suspensión durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos. A continuación, añada 50 microlitros de PBS BSA que contengan anticuerpos anticlonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína al pellet.
Incubar a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Finalmente, después de tres pasos de lavado, resuspender el pellet bacteriano con 300 microlitros de PBS y analizar por citometría de flujo. Para prepararse para ELISA, dispensar 100 microlitros de solución proteica en cada pocóptico de una placa de microtíter PolySorp.
Cierre la placa con la tapa y guárdela a cuatro grados Centígrados durante la noche para facilitar la inmovilización de proteínas en pozos de placas de microtíter. Deseche la solución de la placa de microtíter inclinando boca abajo sobre el fregadero. A continuación, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBS por pozo.
Bloquee los pozos recubiertos durante una hora a temperatura ambiente con PBS que contiene 2.5 por ciento de volumen de peso BSA. Después de retirar la solución de bloqueo, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo. Ahora, agregue 100 microlitros de 50 nanomolares recombinantes a su PH marcado a cada muestra.
En los pozos de control, agregue sólo 100 microlitros de PBS BSA. Incubar el plato durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, deseche la solución proteica y elimine las proteínas no unidas lavando los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo.
A continuación, agregue 100 microlitros de PBS BSA que contengan anticuerpos anti-su policonales conjugados con rábano de caballo peroxidasa. Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo. Detectar los complejos de anticuerpos antígenos mediante la adición de 100 microlitros de reactivo de detección ELISA a cada pozo.
A continuación, agregue 50 microlitros de un ácido sulfúrico molar por pozo para detener la reacción. Mida la densidad óptica de los pozos a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas. Inmovilizar vitronectina humana en sensores reactivos de amina utilizando el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las directrices del fabricante.
Usando PBS, diluya en serie el ligando PH recombinante de cero a cuatro micromolares y transfiera las soluciones resultantes a una placa de microtíter de fondo plano negro de 96 pozos. Ejecute el experimento a 30 grados centígrados utilizando un instrumento de interferometría de capa biológica. Pipetear 10 microlitros de una solución de dos microgramos por mililitro de Vitronectin en PBS en una diapositiva de microscopio de vidrio como una sola gota.
Deje que la gota se seque en el portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos de vidrio recubiertos con proteínas tres veces sumergiéndolos en un vaso de precipitados que contenga PBS durante dos segundos para eliminar el exceso de proteína no recubierta. Ahora, agregue 10 mililitros de un cultivo Hif fresco en un plato de plástico estéril Petri y sumerja los toboganes de vidrio recubiertos en el medio de cultivo.
Incubar los platos a 37 grados centígrados durante una hora con temblor a 20 RPM. Después de la incubación, elimine cualquier bacteria sin ataduras sumergiendo las diapositivas tres veces en un vaso de precipitados lleno de PBS antes de visualizar las bacterias enlazadas por tinción de Gram como se describe en el protocolo de texto. Cultivo A549 células epiteliales como se describe en el protocolo de texto.
Después de un lavado y la tripsinización de las células a 37 grados Celsius, diluir la suspensión celular a 5.000 células por mililitro utilizando un medio completo que contenga cinco microgramos por mililitro de gentamicina. Antes de la infección bacteriana, reemplace el medio en los pozos con F12 medio e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Lave la monocapa celular tres veces con un mililitro de PBS a temperatura ambiente.
A continuación, coloque la placa sobre hielo y 200 microlitros de medio F12 preenfriado que contengan 10 microgramos por mililitro de Vitronectin. Después de incubar la placa a cuatro grados centígrados durante una hora, deseche la solución pipeteando y lave la capa celular dos veces con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Añadir 100 microlitros de tipo salvaje Hif recién crecido en medio F12 a cada pozo.
Incubar la placa durante dos horas a 37 grados centígrados. Luego, aspira el medio con una pipeta y lava las células epiteliales A549 tres veces con PBS. Agregue 50 microlitros por pozo de solución de desprendimiento celular y siga con una incubación de cinco minutos a 37 grados Centígrados.
A continuación, añadir 50 microlitros de F12 medio completo por pozo para detener la reacción enzimática. Transfiera las células epiteliales de cada pozo a un tubo de vidrio de seis mililitros que contenga cuatro cuentas de vidrio. Lyse las células a temperatura ambiente por vórtice durante dos minutos.
Después de diluir el lysate celular 100 veces, plato 10 microlitros de la muestra diluida en un plato de agar de chocolate. Contar las colonias después de una incubación durante la noche a 37 grados centígrados. Realizar el análisis de la resistencia dependiente de vitronectina a la actividad bactericida del suero humano, primer cultivo y pellet las bacterias como se describe en el protocolo de texto.
Después de la centrifugación, resuspender el pellet bacteriano con un volumen de tampón de dextrosa-gelatina-Veronal. Ahora, agregue 1.500 UFC de bacterias a 100 microlitros de DGVB más más que contengan 5% de suero. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos con agitación a 300 RPM.
Retire una alícuota de 10 microlitios de la mezcla de reacción en cero minutos y 15 minutos. Coloque la alícuota sobre el agar chocolate e incubar el plato a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación de las placas de agar de chocolate, cuente las colonias que aparecen en las placas y calcule el porcentaje de bacterias muertas como se describe en el protocolo de texto.
Todos los aislados clínicos de Hif probados en este estudio reclutaron Vitronectin a la superficie celular según lo determinado por la citometría de flujo. La unión de Vitronectin por la cepa De Hif de tipo salvaje causó un cambio en la población, mientras que el mutante no unía a Vitronectin. ELISA estimó las interacciones proteína-proteína entre la proteína principal de unión a Vitronectina PH y Vitronectin.
Los resultados indican una interacción significativa entre PH y Vitronectin y el control positivo en relación con el control negativo. La interacción entre PH y Vitronectin se estimó en tiempo real utilizando interferometría de capa biológica para tener una afinidad de 2,2 micromolares. Además, la falta bacteriana de la expresión de PH en la superficie celular presentaba una menor adherencia a las superficies de vidrio recubiertas de Vitronectina en comparación con las células de tipo silvestre.
Además, la presencia de Vitronectin en la superficie de las células epiteliales mejoró significativamente la adherencia de Hif. Para estimar el complemento que inhibe la actividad de Vitronectin, se examinó la matanza mediada en suero. Las células Hif de tipo salvaje presentaban una mayor resistencia sérica que las células mutantes.
No se mataron bacterias en presencia de suero inactivado por calor. Curiosamente, el tipo salvaje Hif exhibió una menor supervivencia en el suero agotado por Vitronectina y la reposición de Vitronectin aumentó la supervivencia bacteriana. Sin embargo, la cepa mutante no respondió al agotamiento de Vitronectin porque no pudo reclutar Vitronectin a la superficie celular.
Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres o cuatro días para cualquier patógeno y recordar utilizar el cultivo fresco de los patógenos bacterianos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión sobre cómo analizar la unión vitronectina a un patógeno. Además de esta técnica, las proteínas superficiales de unión a Vitronectina de las bacterias se pueden identificar mediante el uso de proteómica e hinchazón occidental.
Esta técnica es importante para los investigadores en el campo de la interacción huésped-patógeno y también para explorar el mecanismo de virulencia en las bacterias.
