Este método proporciona una detección rápida y de alto rendimiento de la adherencia de las bacterias a las células huésped. En comparación con los métodos de recubrimiento convencionales, reduce el tiempo práctico requerido para la cuantificación de las bacterias adherentes. Esta técnica es automatizada, ahorra tiempo y es muy reproducible.
También se aplica ampliamente a la mayoría de las células huésped. Este método, es muy sencillo. Para el primer ensayo, se deben optimizar las condiciones como la multiplicidad de infecciones y también el tiempo de coincubación de las bacterias huésped.
Primero cosechar los cultivos bacterianos en una fase exponencial por centrifugación a 13.000 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de lavar la paleta de celdas con un mililitro pbS, resuspenda la paleta bacteriana en un mililitro PBS. Determine las concentraciones de suspensión bacteriana midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros.
Luego, para teñir la suspensión bacteriana, agregue dos microlitros del tinte de tinción verde o rojo concentrado 500 veces en un mililitro de suspensión bacteriana para diluir el tinte una vez. Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos con una rotación suave en la oscuridad. Después de 30 minutos, centrífuga las bacterias teñidas a 13, 000 veces G durante dos minutos y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS.
Recoger las células bacterianas teñidas por centrifugación a 13.000 veces G durante dos minutos. Resuspender el pellet en un mililitro de medio F12 K fresco y medir la densidad óptica de cada cultivo a 600 nanómetros. Diluir posteriormente los cultivos a las concentraciones deseadas en función de la multiplicidad de la infección y la concentración de células huésped.
Para el ensayo de adherencia bacteriana, lave las capas mono de células A549 previamente cultivadas tres veces agregando 100 microlitros de PBS caliente a cada pozo y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, deseche PBS. Alternativamente, después de agregar PBS, espere 10 segundos y luego retire PBS usando vacío.
Para determinar la cinética de la asociación bacteriana, superponga las células con 100 microlitros de concentraciones deseadas de suspensión bacteriana con diferente multiplicidad de infección. Haga girar las bacterias e incube las células A549 infectadas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante una hora adicional. Elimine las bacterias no unidas lavando las mono capas cinco veces con PBS caliente como se ha demostrado.
A continuación, fije las células agregando 100 microlitros de formaldehído al 4% en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos en el hielo. Después de 15 minutos, lave la placa tres veces con PBS para eliminar la solución de fijación. Tinción en los núcleos con 50 nanogramos por mililitro de tinción DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después de lavar las células con PBS, cubra las células A549 infectadas con 100 microlitros de PBS para evitar que se sequen y luego almacene la placa a cuatro grados Celsius durante un máximo de dos días en la oscuridad o proceda a tomar imágenes. Para mantener la integridad de los datos, elija aleatoria y manualmente cinco ubicaciones de cada pozo para capturar las imágenes con un aumento de 20 veces. Capture las imágenes fluorescentes de las bacterias bajo los canales GFP, las células A549 bajo DAPI, y para las bacterias teñidas por el tinte fluorescente rojo use el canal PE Si cinco.
Establezca los parámetros de la bola rodante para suavizar y mida automáticamente la función de dispersión de puntos de la deconvolución de la imagen en función del objetivo de lograr una mejor resolución. Medir la intensidad de fluorescencia de las células huésped y las bacterias. Establezca la intensidad de fluorescencia más débil de las células huésped y las bacterias como los umbrales para el recuento de células y cuente todas las bacterias cercanas a una célula huésped a una distancia de 15 micrómetros como las bacterias de adherencia.
Una vez que las células se han contado a partir de todas las imágenes automatizadas, analice las lecturas críticas, como los recuentos de células huésped, los tamaños y formas de las células, los recuentos bacterianos totales y la cuenta bacteriana promedio por célula huésped, que es el indicador más importante para determinar la adherencia bacteriana. Después de una hora de coincubación, la cepa PSEUDOMONAS aeruginosa PAO1 se adhirió a las células A549 de manera dependiente de la dosis. También se observaron resultados similares cuando la bacteria grampositiva listeria monocytogenes y su bacillus subtilis de control negativo.
Una imagen representativa de la segmentación de P aeruginosa adherente al huésped demuestra la facilidad de contar las células bacterianas utilizando este protocolo. Los resultados de los análisis automatizados incluyen recuentos de células huésped y bacterianas, los recuentos bacterianos promedio por célula huésped y tamaños de células huésped y áreas que representan el estado de salud de las células huésped, el nivel de adherencia bacteriana y la toxicidad bacteriana de los citocitos. Además de las células A549, los HUVEC también se probaron para el ensayo de adherencia.
Serratia rubidaea y streptococcus agalactiae fueron adherentes a HUVEC, pero no a las células A549, y lo que demuestra la detección efectiva y la idoneidad de múltiples huéspedes para estudiar las interacciones de las bacterias huésped utilizando este método. Las células huésped deben alcanzar alrededor del 90 al 100% de confluencia para minimizar la adherencia de las bacterias indeseables al fondo de los pozos. Esta técnica permitirá a los investigadores explorar los nuevos mecanismos, las interacciones huésped-plaga.
