Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Preparación de cubreobjetos de vidrio <ol><li> Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol al 70% durante al menos 10 min con agitación ocasional para asegurar una exposición total de todos los cubreobjetos a la de etanol. Verter cubreobjetos de vidrio y el etanol en una placa de cultivo celular estéril (ya sea 6 cm o 10 cm de diámetro). </li><li> Con un par de finas 5B pinzas estériles, recoger y colocar cada cubreobjetos individuo en un pocillo de una placa de racimo 24. Tener cuidado para asegurar que los cubreobjetos no tocan las paredes del pozo y son aproximadamente en el centro del pozo. </li><li> Deje la placa de clúster no-cubierta 24 con cubreobjetos de vidrio a secar en la campana de flujo. Esto tarda unos 10 min </li><li> Durante este período, preparar la mezcla de revestimiento diluyendo 10 mg / ml de fibronectina humana en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml. </li><li> Cuando los cubreobjetos son secos, pipeta 100 l de solución de recubrimiento sobre cada co vidrioverslip lo que la solución cubre sólo el vidrio sin la puesta en común alrededor del exterior del pozo. Coloque la placa de 24 pocillos clúster cubierto en una incubadora de cultivo celular durante al menos una hora. </li><li> Justo antes de su uso, retire la solución de revestimiento. La misma solución de recubrimiento puede ser transferida a un tubo estéril y se utilizó hasta tres veces sin pérdida visible de eficacia. </li></ol> 2. Preparación de monocapa de células endoteliales <ol><li> Cultura células endoteliales coronarias humanas de la arteria (CE) en medio a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5%. </li><li> Aspirar fuera medios de cultivo y enjuague monocapa CE con 10 ml de HBSS </li><li> Aspirar HBSS y añadir 2 ml de 0,5% de tripsina, EDTA 0,2%. Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min. </li><li> Cuando CE puede ser desalojado por un grifo para el lado del matraz, añadir 5 ml de inhibidor de tripsina de soja y con pipeta chorree la superficie del matraz para desalojar aún más las células. </li><li> La transferencia de células en un tubo de 15 ml y centrifugar el tuboa 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet CE en 5 ml de medios de comunicación. Contar las células con un hemocitómetro y ajustar la concentración de células a 50.000 CE por ml de medios de comunicación CE. </li><li> Dispensar 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio recubiertos. Se incuban las células O / N en cultivo celular incubadora a 37 ° C, más dióxido de carbono al 5%. </li><li> Las células están listas para su uso en experimentos cuando se forma una monocapa confluente, dentro de 3 días. </li></ol> 3. Preparación de los monocitos <ol><li> Transferencia HL-60 células que son cultivadas en RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal, como cultivo en suspensión, en un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Retire las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio y ajustar la concentración de células con medios de comunicación a 2 millones de células / ml. Si se desea etiquetado de fluorescencia de la HL-60, resuspender las células en RPMI sin suero y proceed como se describe en la sección 4. </li><li> Añadir 0,5 ml de HL-60 suspensión de células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos clúster que contiene monocapa CE y se incuba la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% durante un período fijo de tiempo elegido entre 1 y 3 hora Se observa poca diferencia entre 1 hora y 3 horas de duración punto, donde se alcanza la saturación vinculante. </li><li> Prepárese para celular lavado / recolección: Llenar un tubo de 120 ml con 100 ml de HBSS. Dispensar 1 ml de formalina en cada pocillo de una placa de 24 fresco. </li><li> Después del período de incubación, utilice un par de pinzas afiladas y recoger el cubreobjetos del pozo y mantenga el cubreobjetos vertical y aplique el borde del cubreobjetos en un pedazo de tejido en el banquillo durante 3 segundos, teniendo cuidado de no tocar el superficie de la célula cubierta del cubreobjetos con el tejido. </li><li> Sosteniendo firmemente el cubreobjetos con un par de pinzas, clavada en el cubreobjetos y fuera de los HBSS cinco veces. </li><li> Después de la quinta volcadaen HBSS, aplique el borde del cubreobjetos sobre el tejido durante 3 s. </li><li> Repita los procedimientos dunking y secándose descritos en 3.6 y 3.7, lo que hace un total de tres series de 5 mates seguidos de un lenguado. </li><li> Transferir el cubreobjetos en un pozo que contiene 10% de formalina para fijar las células a TA. El cubreobjetos está listo para la enumeración, para el almacenamiento a largo plazo o ser sometido a otros procedimientos descritos a continuación. </li></ol> 4. Etiquetado de HL-60 células con Rastreador Móvil (opcional) <ol><li> Contar y transferir cantidad apropiada de células HL-60 (por ejemplo, 10 millones) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las células HL-60 a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en Rastreador Celular en medios RPMI sin suero a una concentración de 1 millón de células / ml. Se incuban las células en cultivo celular incubadora durante 1 hr. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en medios a una concentración de 2 millones de canas / ml. </li><li> Añadir 0,5 ml de la etiqueta-Tracker celular HL-60 en cada pocillo que contiene células endoteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Continuar en el 3,3. </li></ol> 5. enumeración de células endoteliales Adhesive <ol><li> Monte cubreobjetos en portaobjetos con DAPI contra-tinción para identificar células individuales. </li><li> Utilizando un microscopio invertido con un objetivo 4X o 10X, adquirir imágenes de varios campos (por ejemplo, 5 campos) y contar el mayor número de monocitos que se agregan en las células endoteliales un-irradiado (Esto normalmente debería ser 3-5). </li><li> Establecer dos veces este número como el umbral de monocitos en una célula endotelial que se define como que un clúster. Si es necesario, un criterio diferente se puede utilizar para definir un clúster dependiendo de la naturaleza del experimento. </li><li> Cuente el número de grupos y el número de células endoteliales en el campo. Dividir la primera por la segunda para obtener el porcentaje de células endoteliales adhesivas. Puntuaciónnumerosos campos para obtener un promedio y desviación estándar de los condes. </li></ol> 6. contratinción con anticuerpos <ol><li> Después de que el ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina al 10% durante 15 min a RT, someter los cubreobjetos a inmunofluorescencia utilizando un procedimiento estándar 10 y anticuerpos de elección. </li><li> Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales. </li></ol> 7. Counterstaining de senescencia asociada a beta-galactosidasa actividad <ol><li> Después del ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina durante 15 minutos, la mancha para la actividad beta-galactosidasa senescencia asociada como se describe en las instrucciones que acompañan el kit de tinción. Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de adhesión de monocitos descrito anteriormente fue utilizado con éxito en experimentos diseñados para estudiar los efectos biológicos de las radiaciones ionizantes en monocapas endoteliales 10. Aunque este no es el único método disponible para evaluar la adhesividad de una monocapa endotelial, que es el único método que permite la cuantificación de la proporción o porcentaje de células endoteliales dentro de una monocapa que es adhesivo. Esta es una distinción importante como un cambio cuantitativo global en la adhesión de los monocitos, tal como se mide por otros métodos pueden atribuirse o bien a un aumento general de la adhesividad de todas las células de la monocapa endotelial o al aumento de la adhesividad de una sub-población de células endoteliales dentro de la monocapa, como se muestra en el ejemplo anterior. El valor de tener esta información se ejemplifica por el hecho de que la capacidad de cuantificar el porcentaje de células endoteliales que exhiben una mayor adhesividad después de la irradiación condujo a los inesconclusión capaz que este efecto no es debido a la mutación genética de un gen en particular como el porcentaje de células que eran adhesivo eran muy por encima (más de 1000 veces más) que la que cabría esperar de mutación aleatoria de un gen por la radiación X a esa dosis . El factor que permite una buena reproducibilidad de los resultados es el régimen de lavado. Como el procedimiento de lavado implica la inmersión de la cubreobjetos de vidrio en el tampón de lavado seguido por secándose en un tejido, se evita la variabilidad en la turbulencia tampón que inevitablemente surge desde el viejo método de pipeteado de la solución tampón de lavado en un pozo. De hecho, fue la observación de la variabilidad excesiva entre las réplicas obtenidas utilizando el método de pipeteado que nos obligó a idear un procedimiento de lavado que elimina el elemento de la variabilidad de la etapa de lavado. Es cierto que las limitaciones de esta mentira de ensayo en la necesidad de llevar a cabo el recuento manual de los racimos de monocitos, que hacer not permita que se puede adaptar para los análisis de alto rendimiento. En segundo lugar, la decisión sobre el número de monocitos constituyen un grupo tiene que ser determinada semi-arbitrariamente y el nivel puede ser demasiado alto y dar lugar a la exclusión de algunos grupos genuinos. La falta de fuerza de cizallamiento en este método también puede ser visto como una limitación en experimentos en los que se induce groseramente mejorada adhesividad de las células endoteliales (por ejemplo, TNF +). En otras situaciones, sin embargo, la falta de fuerza de cizallamiento es una ventaja ya que permite la detección de aumento de menos exagerada de adhesividad. Modesto aumento de la adhesividad de los monocitos puede ser particularmente importante y relevante. In vivo, no (en un tiempo típico experimental) se espera que los monocitos a adjuntar en gran número a las células endoteliales con modesto aumento de la adhesividad, en gran parte debido a la fuerza de cizallamiento. En vez sin embargo, algunos monocitos probablemente haría, y esto es más probable a representar el entorno de inflamación crónica. Como tal,la ausencia de fuerza de cizallamiento puede ser una ventaja, ya que proporciona la oportunidad para que pequeños aumentos de la adhesividad de las células endoteliales para ser revelada en marcos de tiempo experimentales que son típicamente corto y posiblemente demasiado fugaz para permitir modesto aumento en la adhesividad a ser observado bajo tensión de cizallamiento. La capacidad de someter a las células después de este ensayo para otros análisis tales como ensayo de la senescencia y la tinción de inmunofluorescencia aumenta la utilidad de este método, ya que permite la asociación de la adhesividad de las células endoteliales específicas a determinadas proteínas celulares o estados celulares como se demostró anteriormente, una característica que No está disponible con los ensayos de adhesión mayores. Este método ha sido utilizado con células coronarias humanas Est2-inmortalizado endoteliales y resultados similares se obtuvieron también con las células endoteliales coronarias humanas primarias 10, demostrando que no es específica para sólo una línea celular particular. Además, el ruido y pocasption de este método de ensayo de adhesividad de las células endoteliales no se oponen a someter a las mismas células para el ensayo de adhesión estándar que mide la fluorescencia de inmunocitos etiquetados. En conjunto, este informe demuestra que este método es muy versátil, incluyente y ofrece mucha más información que el ensayo de adhesión estándar.

La infiltración de células inmunes tales como monocitos a través de la capa de células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos es un paso importante en el proceso de inflamación 1. Esto permite que el homing de las células inmunes (inmunocitos) a un sitio de la lesión. En otros casos y ubicaciones tales como la arteria coronaria y la arteria carótida, la infiltración de monocitos a través de la capa endotelial puede conducir a la indeseable residencia a largo plazo de estas células en la pared de la arteria, que puede conducir a la formación de placas 2. En todos los casos de infiltración de inmunocitos, el primer paso implica la activación de las células endoteliales en una región localizada del vaso sanguíneo. Las células endoteliales se activan por las citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α e IL-6 para aumentar la expresión de proteínas de superficie celular tales como VCAM, ICAM y E-selectina que facilitan el reclutamiento y la fijación de los inmunocitos sobre la superficie de las células endoteliales 3- 6. 7. Las limitaciones de este método en términos de precisión llevado a la utilización de linfocitos radio-marcado o monocitos, seguido por cuantificación de material radiactivo que corresponde a los linfocitos o monocitos adhesión 4. Este método fue eventualmente reemplazado por un método basado en la fluorescencia, lo cual inmunocitos de interés se marcaron con colorante fluorescente y se sometieron al mismo procedimiento que el anterior con la diferencia de que en lugar de fluorescencia de la radiactividad se mide 8. Actualmente este método se ha convertido en la más conveniente y se vende en forma de kit por varios proveedores comerciales. Mientras que este ensayo puede medir los niveles relativos de adhesividad entre los controles y las muestras experimentales, que no revela si un cambio en la fluorescencia es debido a un cambio uniforme en adhesividad a través de todo el correopoblación de células ndothelial o si el cambio es debido a una diferencia de adhesividad dentro de una sub-población de células. También es evidente que la rigurosidad de lavado ejerce un profundo efecto en el resultado, y más importante, la uniformidad de enjuagar monocitos no unidos entre diferentes monocapas de células endoteliales será de gran impacto en la cercanía de los resultados de repeticiones y la reproducibilidad de los resultados entre las muestras . Más recientemente, se han utilizado varios sistemas que bombean los monocitos en los medios de comunicación a través de una monocapa de células endoteliales para abordar este problema 9. Además, estos sistemas de flujo también recapitulan el efecto de la fuerza de cizallamiento sobre las células endoteliales. Mientras que las ventajas de tales sistemas son claros y muy atractivo, también es importante darse cuenta de que mientras que la adhesividad de las células endoteliales puede ser enormemente aumentada, como es el caso en la inflamación aguda, por factores tales como TNFa, algunos otros activadores, tales como la radiación ionizante 10 elicit cambia tsombrero no se detectan fácilmente dentro de marcos de tiempo in vitro por estos sistemas experimentales muy estrictas. Mientras que tales cambios minutos de la adhesividad de las células endoteliales son fácilmente perdidas o despedidos in vitro, no es necesariamente benigna in vivo, donde tales cambios pequeños dentro de un tiempo de vida, que es característica de la inflamación crónica, pueden ejercer resultados muy significativos. Por lo tanto un método robusto, pero sensible y específica para detectar y medir es necesaria adhesividad de las células endoteliales. Aquí, se presenta un método para medir la adherencia de las células endoteliales directamente. Este método no se basa en la medición de fluorescencia como un indicador sustituto indirecta de la adhesividad de las células endoteliales. Revela si los cambios en la adherencia se deben a un cambio uniforme en todas las células o confinado a una subpoblación. Además, permite co-tinción de las células endoteliales con marcadores tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia, mar viabilidad celularker, calcien AM y anticuerpos contra la superficie celular y las proteínas intracelulares, lo que permite la asociación de las células endoteliales adhesivas individuales para ciertos estados celulares o expresión de proteínas específicas.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Uno de los procesos cardinales de la inflamación es la infiltración de células inmunes desde el lumen del vaso sanguíneo en el tejido circundante. Esto ocurre cuando las células endoteliales, que revisten los vasos sanguíneos, se convierten adhesivo a células inmunes circulantes tales como monocitos. In vitro medición de este adhesividad ha sido hasta ahora hecho mediante la cuantificación de la cantidad total de los monocitos que se adhieren a una capa endotelial ya sea como un recuento directo o por medición indirecta de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Aunque tales medidas hacen indicar la adhesividad media de la población de células endoteliales, que son confundidos por una serie de factores, como el número de células, y no revelan la proporción de células endoteliales que son realmente adhesivo. Aquí describimos y demostrar un método que permite la enumeración de las células adhesivas dentro de una población probado de monocapa endotelial. Las células endoteliales se cultivan en cubreobjetos de vidrio y siguientes deseadastratamiento son desafiados con monocitos (que pueden ser etiquetados con fluorescencia). Después de la incubación, un procedimiento de enjuague, que implica múltiples rondas de inmersión y de drenaje, las células se fijan. Células endoteliales adhesivas, que están rodeados por los monocitos son fácilmente identificados y enumerados, dando un índice de adhesión que revela la proporción real de células endoteliales dentro de la población que son adhesivo.

Este método permite la detección de células endoteliales adhesivas individuales dentro de una población. Por ejemplo, mientras que una monocapa de células endoteliales un-irradiado retuvo unos esporádicos HL-60 monocitos después de la incubación y el lavado, monocapa endotelial a los 7 días posteriores a 10 Gy de irradiación antes de la incubación con monocitos fueron obligados por los monocitos en grupos alrededor de las células endoteliales individuales ( Figura 1). Aunque este fenómeno es fácilmente observable bajo microscopía de contraste de fase, microscopía de fluorescencia revela una imagen aún más clara de los racimos de monocitos. Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, es posible proceder a la tinción de las células para la membrana, citoplasma o nuclear (Figura 2) las proteínas usando anticuerpos apropiados con métodos de inmunofluorescencia estándar. Además, el ensayo a base de enzimas tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia (Figura 3) también puede ser performed. Dado que cada grupo de monocitos corresponde a una célula endotelial individual, la enumeración de los grupos revelará el número real de células endoteliales de adhesivo dentro de la monocapa (Figura 4), ​​y por lo tanto el porcentaje de células endoteliales de adhesivo dentro de la población (Tabla 1, Figura 6) . Este es el único método que permite que hasta la fecha tal cuantificación de la adhesividad de las células endoteliales. Es de destacar que las células endoteliales utilizadas en los experimentos aquí son el contacto inhibido y no aumentan en número después de alcanzar la confluencia. Esto elimina la complejidad potencial planteado por el aumento del número de células endoteliales en momentos posteriores. Si se desea, los monocitos unidos a monocapas endoteliales pueden ser desalojados por la solución de tripsina-EDTA 0,2% 0,5% (en lugar de la fijación en 3.9) y su fluorescencia miden usando un lector de placas, como es el caso en métodos contemporáneos (Figura 5). </p&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figura 1. La adhesión de los monocitos en monocapa de células endoteliales. En las células endoteliales un-irradiado, los monocitos se adhirieron como células individuales en una manera esporádica y aleatoria (paneles de la izquierda) y en grupos en las células endoteliales individuales de los 7 días post-10 Gy irradiados monocapa (paneles de la derecha). Paneles inferiores son imágenes de fluorescencia de los paneles superiores, lo que confirma que las células esféricas pequeñas y brillantes visibles bajo contraste de fase son de hecho los monocitos que fueron pre-etiquetados con Cell-Tracker Verde. Algunos de los racimos de monocitos se indican mediante flechas blancas. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figura 2. Tinción de las células endoteliales para el ensayo de proteínas post-adhesión. Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, las células en los cubreobjetos de vidrio se sometieron a inmunofluorescencia para la detección de (A) proteína de la membrana (CD44), b) proteína citoplasmática (tubulina) o c) la proteína nuclear (γ-H2AX). Paneles de la izquierda de (A) y (B) (visto con objetivo 20X) muestran monocitos pre-etiquetados con Cell Rastreador verde y la imagen similar sobre los paneles de la derecha muestran CD44 y los microtúbulos (rojo) y los núcleos teñidos con DAPI (azul). Flechas blancas en (C) Punto de núcleos de células endoteliales irradiados que se tiñeron con anticuerpos contra γ-H2AX. Núcleos de monocitos que se tiñe de un azul más brillante por DAPI se distinguen fácilmente de los núcleos de forma ovalada de las células endoteliales. Las imágenes fueron tomadas con el objetivo 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figura 3. asociada a la senescencia tinción beta-galactosidasa de las células endoteliales. Después de ensayo de adhesión, las células en cubreobjetos fueron sometidos a tinción para beta-galactosidasa asociada a la senescencia que hace que los lisosomas de las células senescentes para vuelven azules, como es evidente en la célula endotelial que se une selectivamente por numerosos monocitos, que son fácilmente identificados debido a su pequeño tamaño y la forma esférica. Imagen vista a través objetivo 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Enumeración de racimos de monocitos en las células endoteliales individuales. Después de ensayo de adhesión, las imágenes de las células fueron tomadas de varias posiciones diferentes y racimos de monocitos identificados y rodeó (en verde). Un grupo se definió como una aglomeración de 10 o más monocitos en una célula endotelial. Se contó el número de grupos de monocitos y número de células endoteliales 12 días post-irradiados (punteada en rojo) en la imagen y el porcentaje de células endoteliales adherentes calculados como se muestra en la Tabla 1. Imagen tomada a través objetivo de 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figura 5. La cuantificación de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Siguiendo adhe<html> Sion ensayo, las células en cubreobjetos de vidrio se tripsinizaron y la fluorescencia de los monocitos pre-marcado con verde CellTracker se midió, usando un lector de placas de fluorescencia, como un indicador indirecto de la adhesividad de la monocapa endotelial. Los resultados de estas mediciones en días indicados después de la irradiación se obtuvieron y entretejieron en el gráfico anterior. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figura 6. Representación de las puntuaciones de ensayo de adhesión de la Tabla 1. Las células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se puntuaron como se describe en la Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de irradiado células endoteliales se convirtieron adhesivo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Porcentaje de adhesivo células endoteliales </td></tr><tr><td></td><td> Disco 1 </td><td> Disco 2 </td><td> Disco 3 </td></tr><tr><td> Campo 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Campo 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> El campo 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> El campo 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Campo 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Promedio </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Adherencia puntajes de ensayo. Células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se calificaron como se describe en Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de las células endoteliales irradiados se convirtió en adhesivo.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K vistas.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Investigación

Bioingeniería

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Inmunología e Infección

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial

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