We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Preparación de cubreobjetos de vidrio <ol><li> Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol al 70% durante al menos 10 min con agitación ocasional para asegurar una exposición total de todos los cubreobjetos a la de etanol. Verter cubreobjetos de vidrio y el etanol en una placa de cultivo celular estéril (ya sea 6 cm o 10 cm de diámetro). </li><li> Con un par de finas 5B pinzas estériles, recoger y colocar cada cubreobjetos individuo en un pocillo de una placa de racimo 24. Tener cuidado para asegurar que los cubreobjetos no tocan las paredes del pozo y son aproximadamente en el centro del pozo. </li><li> Deje la placa de clúster no-cubierta 24 con cubreobjetos de vidrio a secar en la campana de flujo. Esto tarda unos 10 min </li><li> Durante este período, preparar la mezcla de revestimiento diluyendo 10 mg / ml de fibronectina humana en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 0,1 mg / ml. </li><li> Cuando los cubreobjetos son secos, pipeta 100 l de solución de recubrimiento sobre cada co vidrioverslip lo que la solución cubre sólo el vidrio sin la puesta en común alrededor del exterior del pozo. Coloque la placa de 24 pocillos clúster cubierto en una incubadora de cultivo celular durante al menos una hora. </li><li> Justo antes de su uso, retire la solución de revestimiento. La misma solución de recubrimiento puede ser transferida a un tubo estéril y se utilizó hasta tres veces sin pérdida visible de eficacia. </li></ol> 2. Preparación de monocapa de células endoteliales <ol><li> Cultura células endoteliales coronarias humanas de la arteria (CE) en medio a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5%. </li><li> Aspirar fuera medios de cultivo y enjuague monocapa CE con 10 ml de HBSS </li><li> Aspirar HBSS y añadir 2 ml de 0,5% de tripsina, EDTA 0,2%. Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min. </li><li> Cuando CE puede ser desalojado por un grifo para el lado del matraz, añadir 5 ml de inhibidor de tripsina de soja y con pipeta chorree la superficie del matraz para desalojar aún más las células. </li><li> La transferencia de células en un tubo de 15 ml y centrifugar el tuboa 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet CE en 5 ml de medios de comunicación. Contar las células con un hemocitómetro y ajustar la concentración de células a 50.000 CE por ml de medios de comunicación CE. </li><li> Dispensar 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio recubiertos. Se incuban las células O / N en cultivo celular incubadora a 37 ° C, más dióxido de carbono al 5%. </li><li> Las células están listas para su uso en experimentos cuando se forma una monocapa confluente, dentro de 3 días. </li></ol> 3. Preparación de los monocitos <ol><li> Transferencia HL-60 células que son cultivadas en RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal, como cultivo en suspensión, en un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Retire las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio y ajustar la concentración de células con medios de comunicación a 2 millones de células / ml. Si se desea etiquetado de fluorescencia de la HL-60, resuspender las células en RPMI sin suero y proceed como se describe en la sección 4. </li><li> Añadir 0,5 ml de HL-60 suspensión de células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos clúster que contiene monocapa CE y se incuba la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% durante un período fijo de tiempo elegido entre 1 y 3 hora Se observa poca diferencia entre 1 hora y 3 horas de duración punto, donde se alcanza la saturación vinculante. </li><li> Prepárese para celular lavado / recolección: Llenar un tubo de 120 ml con 100 ml de HBSS. Dispensar 1 ml de formalina en cada pocillo de una placa de 24 fresco. </li><li> Después del período de incubación, utilice un par de pinzas afiladas y recoger el cubreobjetos del pozo y mantenga el cubreobjetos vertical y aplique el borde del cubreobjetos en un pedazo de tejido en el banquillo durante 3 segundos, teniendo cuidado de no tocar el superficie de la célula cubierta del cubreobjetos con el tejido. </li><li> Sosteniendo firmemente el cubreobjetos con un par de pinzas, clavada en el cubreobjetos y fuera de los HBSS cinco veces. </li><li> Después de la quinta volcadaen HBSS, aplique el borde del cubreobjetos sobre el tejido durante 3 s. </li><li> Repita los procedimientos dunking y secándose descritos en 3.6 y 3.7, lo que hace un total de tres series de 5 mates seguidos de un lenguado. </li><li> Transferir el cubreobjetos en un pozo que contiene 10% de formalina para fijar las células a TA. El cubreobjetos está listo para la enumeración, para el almacenamiento a largo plazo o ser sometido a otros procedimientos descritos a continuación. </li></ol> 4. Etiquetado de HL-60 células con Rastreador Móvil (opcional) <ol><li> Contar y transferir cantidad apropiada de células HL-60 (por ejemplo, 10 millones) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las células HL-60 a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en Rastreador Celular en medios RPMI sin suero a una concentración de 1 millón de células / ml. Se incuban las células en cultivo celular incubadora durante 1 hr. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en medios a una concentración de 2 millones de canas / ml. </li><li> Añadir 0,5 ml de la etiqueta-Tracker celular HL-60 en cada pocillo que contiene células endoteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Continuar en el 3,3. </li></ol> 5. enumeración de células endoteliales Adhesive <ol><li> Monte cubreobjetos en portaobjetos con DAPI contra-tinción para identificar células individuales. </li><li> Utilizando un microscopio invertido con un objetivo 4X o 10X, adquirir imágenes de varios campos (por ejemplo, 5 campos) y contar el mayor número de monocitos que se agregan en las células endoteliales un-irradiado (Esto normalmente debería ser 3-5). </li><li> Establecer dos veces este número como el umbral de monocitos en una célula endotelial que se define como que un clúster. Si es necesario, un criterio diferente se puede utilizar para definir un clúster dependiendo de la naturaleza del experimento. </li><li> Cuente el número de grupos y el número de células endoteliales en el campo. Dividir la primera por la segunda para obtener el porcentaje de células endoteliales adhesivas. Puntuaciónnumerosos campos para obtener un promedio y desviación estándar de los condes. </li></ol> 6. contratinción con anticuerpos <ol><li> Después de que el ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina al 10% durante 15 min a RT, someter los cubreobjetos a inmunofluorescencia utilizando un procedimiento estándar 10 y anticuerpos de elección. </li><li> Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales. </li></ol> 7. Counterstaining de senescencia asociada a beta-galactosidasa actividad <ol><li> Después del ensayo de adhesión y las células en el cubreobjetos se han fijado en formalina durante 15 minutos, la mancha para la actividad beta-galactosidasa senescencia asociada como se describe en las instrucciones que acompañan el kit de tinción. Añadir y eliminar las diversas soluciones muy suavemente para evitar que se desprenda monocitos que se unen a las células endoteliales. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de adhesión de monocitos descrito anteriormente fue utilizado con éxito en experimentos diseñados para estudiar los efectos biológicos de las radiaciones ionizantes en monocapas endoteliales 10. Aunque este no es el único método disponible para evaluar la adhesividad de una monocapa endotelial, que es el único método que permite la cuantificación de la proporción o porcentaje de células endoteliales dentro de una monocapa que es adhesivo. Esta es una distinción importante como un cambio cuantitativo global en la adhesión de los monocitos, tal como se mide por otros métodos pueden atribuirse o bien a un aumento general de la adhesividad de todas las células de la monocapa endotelial o al aumento de la adhesividad de una sub-población de células endoteliales dentro de la monocapa, como se muestra en el ejemplo anterior. El valor de tener esta información se ejemplifica por el hecho de que la capacidad de cuantificar el porcentaje de células endoteliales que exhiben una mayor adhesividad después de la irradiación condujo a los inesconclusión capaz que este efecto no es debido a la mutación genética de un gen en particular como el porcentaje de células que eran adhesivo eran muy por encima (más de 1000 veces más) que la que cabría esperar de mutación aleatoria de un gen por la radiación X a esa dosis . El factor que permite una buena reproducibilidad de los resultados es el régimen de lavado. Como el procedimiento de lavado implica la inmersión de la cubreobjetos de vidrio en el tampón de lavado seguido por secándose en un tejido, se evita la variabilidad en la turbulencia tampón que inevitablemente surge desde el viejo método de pipeteado de la solución tampón de lavado en un pozo. De hecho, fue la observación de la variabilidad excesiva entre las réplicas obtenidas utilizando el método de pipeteado que nos obligó a idear un procedimiento de lavado que elimina el elemento de la variabilidad de la etapa de lavado. Es cierto que las limitaciones de esta mentira de ensayo en la necesidad de llevar a cabo el recuento manual de los racimos de monocitos, que hacer not permita que se puede adaptar para los análisis de alto rendimiento. En segundo lugar, la decisión sobre el número de monocitos constituyen un grupo tiene que ser determinada semi-arbitrariamente y el nivel puede ser demasiado alto y dar lugar a la exclusión de algunos grupos genuinos. La falta de fuerza de cizallamiento en este método también puede ser visto como una limitación en experimentos en los que se induce groseramente mejorada adhesividad de las células endoteliales (por ejemplo, TNF +). En otras situaciones, sin embargo, la falta de fuerza de cizallamiento es una ventaja ya que permite la detección de aumento de menos exagerada de adhesividad. Modesto aumento de la adhesividad de los monocitos puede ser particularmente importante y relevante. In vivo, no (en un tiempo típico experimental) se espera que los monocitos a adjuntar en gran número a las células endoteliales con modesto aumento de la adhesividad, en gran parte debido a la fuerza de cizallamiento. En vez sin embargo, algunos monocitos probablemente haría, y esto es más probable a representar el entorno de inflamación crónica. Como tal,la ausencia de fuerza de cizallamiento puede ser una ventaja, ya que proporciona la oportunidad para que pequeños aumentos de la adhesividad de las células endoteliales para ser revelada en marcos de tiempo experimentales que son típicamente corto y posiblemente demasiado fugaz para permitir modesto aumento en la adhesividad a ser observado bajo tensión de cizallamiento. La capacidad de someter a las células después de este ensayo para otros análisis tales como ensayo de la senescencia y la tinción de inmunofluorescencia aumenta la utilidad de este método, ya que permite la asociación de la adhesividad de las células endoteliales específicas a determinadas proteínas celulares o estados celulares como se demostró anteriormente, una característica que No está disponible con los ensayos de adhesión mayores. Este método ha sido utilizado con células coronarias humanas Est2-inmortalizado endoteliales y resultados similares se obtuvieron también con las células endoteliales coronarias humanas primarias 10, demostrando que no es específica para sólo una línea celular particular. Además, el ruido y pocasption de este método de ensayo de adhesividad de las células endoteliales no se oponen a someter a las mismas células para el ensayo de adhesión estándar que mide la fluorescencia de inmunocitos etiquetados. En conjunto, este informe demuestra que este método es muy versátil, incluyente y ofrece mucha más información que el ensayo de adhesión estándar.

La infiltración de células inmunes tales como monocitos a través de la capa de células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos es un paso importante en el proceso de inflamación 1. Esto permite que el homing de las células inmunes (inmunocitos) a un sitio de la lesión. En otros casos y ubicaciones tales como la arteria coronaria y la arteria carótida, la infiltración de monocitos a través de la capa endotelial puede conducir a la indeseable residencia a largo plazo de estas células en la pared de la arteria, que puede conducir a la formación de placas 2. En todos los casos de infiltración de inmunocitos, el primer paso implica la activación de las células endoteliales en una región localizada del vaso sanguíneo. Las células endoteliales se activan por las citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α e IL-6 para aumentar la expresión de proteínas de superficie celular tales como VCAM, ICAM y E-selectina que facilitan el reclutamiento y la fijación de los inmunocitos sobre la superficie de las células endoteliales 3- 6. 7. Las limitaciones de este método en términos de precisión llevado a la utilización de linfocitos radio-marcado o monocitos, seguido por cuantificación de material radiactivo que corresponde a los linfocitos o monocitos adhesión 4. Este método fue eventualmente reemplazado por un método basado en la fluorescencia, lo cual inmunocitos de interés se marcaron con colorante fluorescente y se sometieron al mismo procedimiento que el anterior con la diferencia de que en lugar de fluorescencia de la radiactividad se mide 8. Actualmente este método se ha convertido en la más conveniente y se vende en forma de kit por varios proveedores comerciales. Mientras que este ensayo puede medir los niveles relativos de adhesividad entre los controles y las muestras experimentales, que no revela si un cambio en la fluorescencia es debido a un cambio uniforme en adhesividad a través de todo el correopoblación de células ndothelial o si el cambio es debido a una diferencia de adhesividad dentro de una sub-población de células. También es evidente que la rigurosidad de lavado ejerce un profundo efecto en el resultado, y más importante, la uniformidad de enjuagar monocitos no unidos entre diferentes monocapas de células endoteliales será de gran impacto en la cercanía de los resultados de repeticiones y la reproducibilidad de los resultados entre las muestras . Más recientemente, se han utilizado varios sistemas que bombean los monocitos en los medios de comunicación a través de una monocapa de células endoteliales para abordar este problema 9. Además, estos sistemas de flujo también recapitulan el efecto de la fuerza de cizallamiento sobre las células endoteliales. Mientras que las ventajas de tales sistemas son claros y muy atractivo, también es importante darse cuenta de que mientras que la adhesividad de las células endoteliales puede ser enormemente aumentada, como es el caso en la inflamación aguda, por factores tales como TNFa, algunos otros activadores, tales como la radiación ionizante 10 elicit cambia tsombrero no se detectan fácilmente dentro de marcos de tiempo in vitro por estos sistemas experimentales muy estrictas. Mientras que tales cambios minutos de la adhesividad de las células endoteliales son fácilmente perdidas o despedidos in vitro, no es necesariamente benigna in vivo, donde tales cambios pequeños dentro de un tiempo de vida, que es característica de la inflamación crónica, pueden ejercer resultados muy significativos. Por lo tanto un método robusto, pero sensible y específica para detectar y medir es necesaria adhesividad de las células endoteliales. Aquí, se presenta un método para medir la adherencia de las células endoteliales directamente. Este método no se basa en la medición de fluorescencia como un indicador sustituto indirecta de la adhesividad de las células endoteliales. Revela si los cambios en la adherencia se deben a un cambio uniforme en todas las células o confinado a una subpoblación. Además, permite co-tinción de las células endoteliales con marcadores tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia, mar viabilidad celularker, calcien AM y anticuerpos contra la superficie celular y las proteínas intracelulares, lo que permite la asociación de las células endoteliales adhesivas individuales para ciertos estados celulares o expresión de proteínas específicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Uno de los procesos cardinales de la inflamación es la infiltración de células inmunes desde el lumen del vaso sanguíneo en el tejido circundante. Esto ocurre cuando las células endoteliales, que revisten los vasos sanguíneos, se convierten adhesivo a células inmunes circulantes tales como monocitos. In vitro medición de este adhesividad ha sido hasta ahora hecho mediante la cuantificación de la cantidad total de los monocitos que se adhieren a una capa endotelial ya sea como un recuento directo o por medición indirecta de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Aunque tales medidas hacen indicar la adhesividad media de la población de células endoteliales, que son confundidos por una serie de factores, como el número de células, y no revelan la proporción de células endoteliales que son realmente adhesivo. Aquí describimos y demostrar un método que permite la enumeración de las células adhesivas dentro de una población probado de monocapa endotelial. Las células endoteliales se cultivan en cubreobjetos de vidrio y siguientes deseadastratamiento son desafiados con monocitos (que pueden ser etiquetados con fluorescencia). Después de la incubación, un procedimiento de enjuague, que implica múltiples rondas de inmersión y de drenaje, las células se fijan. Células endoteliales adhesivas, que están rodeados por los monocitos son fácilmente identificados y enumerados, dando un índice de adhesión que revela la proporción real de células endoteliales dentro de la población que son adhesivo.

Este método permite la detección de células endoteliales adhesivas individuales dentro de una población. Por ejemplo, mientras que una monocapa de células endoteliales un-irradiado retuvo unos esporádicos HL-60 monocitos después de la incubación y el lavado, monocapa endotelial a los 7 días posteriores a 10 Gy de irradiación antes de la incubación con monocitos fueron obligados por los monocitos en grupos alrededor de las células endoteliales individuales ( Figura 1). Aunque este fenómeno es fácilmente observable bajo microscopía de contraste de fase, microscopía de fluorescencia revela una imagen aún más clara de los racimos de monocitos. Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, es posible proceder a la tinción de las células para la membrana, citoplasma o nuclear (Figura 2) las proteínas usando anticuerpos apropiados con métodos de inmunofluorescencia estándar. Además, el ensayo a base de enzimas tales como beta-galactosidasa asociada a la senescencia (Figura 3) también puede ser performed. Dado que cada grupo de monocitos corresponde a una célula endotelial individual, la enumeración de los grupos revelará el número real de células endoteliales de adhesivo dentro de la monocapa (Figura 4), ​​y por lo tanto el porcentaje de células endoteliales de adhesivo dentro de la población (Tabla 1, Figura 6) . Este es el único método que permite que hasta la fecha tal cuantificación de la adhesividad de las células endoteliales. Es de destacar que las células endoteliales utilizadas en los experimentos aquí son el contacto inhibido y no aumentan en número después de alcanzar la confluencia. Esto elimina la complejidad potencial planteado por el aumento del número de células endoteliales en momentos posteriores. Si se desea, los monocitos unidos a monocapas endoteliales pueden ser desalojados por la solución de tripsina-EDTA 0,2% 0,5% (en lugar de la fijación en 3.9) y su fluorescencia miden usando un lector de placas, como es el caso en métodos contemporáneos (Figura 5). </p&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figura 1. La adhesión de los monocitos en monocapa de células endoteliales. En las células endoteliales un-irradiado, los monocitos se adhirieron como células individuales en una manera esporádica y aleatoria (paneles de la izquierda) y en grupos en las células endoteliales individuales de los 7 días post-10 Gy irradiados monocapa (paneles de la derecha). Paneles inferiores son imágenes de fluorescencia de los paneles superiores, lo que confirma que las células esféricas pequeñas y brillantes visibles bajo contraste de fase son de hecho los monocitos que fueron pre-etiquetados con Cell-Tracker Verde. Algunos de los racimos de monocitos se indican mediante flechas blancas. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figura 2. Tinción de las células endoteliales para el ensayo de proteínas post-adhesión. Después de realizar el ensayo de adhesión descrito, las células en los cubreobjetos de vidrio se sometieron a inmunofluorescencia para la detección de (A) proteína de la membrana (CD44), b) proteína citoplasmática (tubulina) o c) la proteína nuclear (γ-H2AX). Paneles de la izquierda de (A) y (B) (visto con objetivo 20X) muestran monocitos pre-etiquetados con Cell Rastreador verde y la imagen similar sobre los paneles de la derecha muestran CD44 y los microtúbulos (rojo) y los núcleos teñidos con DAPI (azul). Flechas blancas en (C) Punto de núcleos de células endoteliales irradiados que se tiñeron con anticuerpos contra γ-H2AX. Núcleos de monocitos que se tiñe de un azul más brillante por DAPI se distinguen fácilmente de los núcleos de forma ovalada de las células endoteliales. Las imágenes fueron tomadas con el objetivo 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figura 3. asociada a la senescencia tinción beta-galactosidasa de las células endoteliales. Después de ensayo de adhesión, las células en cubreobjetos fueron sometidos a tinción para beta-galactosidasa asociada a la senescencia que hace que los lisosomas de las células senescentes para vuelven azules, como es evidente en la célula endotelial que se une selectivamente por numerosos monocitos, que son fácilmente identificados debido a su pequeño tamaño y la forma esférica. Imagen vista a través objetivo 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Enumeración de racimos de monocitos en las células endoteliales individuales. Después de ensayo de adhesión, las imágenes de las células fueron tomadas de varias posiciones diferentes y racimos de monocitos identificados y rodeó (en verde). Un grupo se definió como una aglomeración de 10 o más monocitos en una célula endotelial. Se contó el número de grupos de monocitos y número de células endoteliales 12 días post-irradiados (punteada en rojo) en la imagen y el porcentaje de células endoteliales adherentes calculados como se muestra en la Tabla 1. Imagen tomada a través objetivo de 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figura 5. La cuantificación de la fluorescencia de los monocitos adherentes. Siguiendo adhe<html> Sion ensayo, las células en cubreobjetos de vidrio se tripsinizaron y la fluorescencia de los monocitos pre-marcado con verde CellTracker se midió, usando un lector de placas de fluorescencia, como un indicador indirecto de la adhesividad de la monocapa endotelial. Los resultados de estas mediciones en días indicados después de la irradiación se obtuvieron y entretejieron en el gráfico anterior. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figura 6. Representación de las puntuaciones de ensayo de adhesión de la Tabla 1. Las células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se puntuaron como se describe en la Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de irradiado células endoteliales se convirtieron adhesivo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Porcentaje de adhesivo células endoteliales </td></tr><tr><td></td><td> Disco 1 </td><td> Disco 2 </td><td> Disco 3 </td></tr><tr><td> Campo 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Campo 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> El campo 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> El campo 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Campo 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Promedio </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Adherencia puntajes de ensayo. Células endoteliales adhesivas en cinco lugares diferentes en tres cubreobjetos de vidrio se calificaron como se describe en Figura 4 y los resultados tabulados anteriormente que demuestra que 12 días después de 10 Gy de irradiación, de 8 a 10 por ciento de las células endoteliales irradiados se convirtió en adhesivo.

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Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La cuantificación de la adhesividad de la célula endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K vistas.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Investigación

Biología

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...