Estos estudios fueron financiados por CIHR y becas CBCRA a DWL. IP fue financiado por becas de CIHR-STP, FRSQ y CIHR. MKGS fue financiado por becas OGS y CIHR STP. Los autores agradecen a Kevin Barr por su ayuda con la cría de ratón.

1. Disección de la glándula mamaria <ol><li> Practicar la eutanasia con el ratón usando inhalación de CO 2. Evitar la dislocación cervical, si es posible, ya que puede dañar los vasos sanguíneos importantes en el cuello y el resultado de la acumulación de sangre alrededor de las glándulas mamarias, lo que hace la disección más difícil. Sin embargo, si otros criterios que se evaluarán en el mismo ratón, tales como los niveles de oxitocina, métodos alternativos de la eutanasia puede ser necesaria, aunque esto debe ser evaluado por su IACUC. </li><li> En una espuma de poliestireno envueltos en papel de aluminio, colocar el ratón sobre la espalda y la propagación de las cuatro extremidades. Pin firmemente las cuatro extremidades con 16 a 20 agujas de calibre (fig. 1A). </li><li> Rocíe el ratón generosamente con etanol al 70%. </li><li> El uso de pinzas, tire de la piel del abdomen en la línea media y hacer una pequeña incisión con tijeras afiladas. </li><li> A partir de la incisión, corte la piel hasta el cuello del animal y evitar la punción de la cavidad abdominal o torácica (fig. 1B). </li><li> Cortar la piel de las patas delanteras de la incisión de línea media, lo que resulta en una &quot;forma de Y&quot; (fig. 1B). Cortar la piel de las extremidades traseras de la misma manera (fig. 1B). </li><li> El uso de pinzas hemostáticas, pelar suavemente la piel abdominal y torácica en el lado del ratón. Si es necesario, con suavidad cortar el tejido conjuntivo. </li><li> Fijar la piel a la espuma de poliestireno con 16 a 20 agujas de calibre, la exposición de las glándulas mamarias adjunta a la parte inferior de la piel. Continuar y completar un lado a la vez (fig. 1C). </li><li> Con unas pinzas, levante suavemente la glándula mamaria de interés y reducir entre la glándula y la piel con pequeñas tijeras afiladas, a partir desde el exterior hacia la espina dorsal del animal. Asegúrese de que cortar cuidadosamente, de modo que ningún pedazo de la piel o los músculos permanecen en la glándula. Todas las glándulas mamarias (Figura 1) se pueden eliminar con este protocolo, pero abdominal glándulas mamarias (# 4) son los mejores para el montaje de todo. La 2 ª y 3 ª glándulas tener algunos músculos interdigitados y aunque se puede utilizar para montar todo y la histología, que podría no ser apropiado para todos los análisis. </li></ol> 2. Todo el montaje <ol><li> Al menos un día antes de la disección, preparar una solución de carmín alumbre por disolución de 1 g de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de agua destilada y hervir durante 20 minutos en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Ajustar el volumen final de 500 ml con agua. Filtrar a través de un papel Whatman y añadir una pequeña cantidad de timol (algunos granos) como conservante. Refrigerar. Después de la tinción, solución de carmín alumbre puede ser vertida de nuevo a la botella de valores y reutilizar muchas veces durante varias semanas. Prepare una solución fresca cuando el color se debilita. </li><li> Después de extirpar la glándula mamaria del ratón (paso 1), se extendió directamente en un portaobjetos de vidrio. Tratar de aplanar la medida de lo posible, conservando el original en la forma in situ. La glándula se pega en la diapositiva muy bien cuando bien tirante. </li><li> Fijar la glándula por inmersión, en la diapositiva, en el fijador de Carnoy (EtOH al 100%, cloroformo, ácido acético glacial, 06:03:01) durante 4 horas en la campana de extracción a temperatura ambiente en un frasco. Tenga en cuenta que otros han utilizado dos horas, que parece ser suficiente. Por otra parte, las glándulas también puede ser fijado a 4 ° C durante la noche. </li><li> De lavado en etanol al 70% durante 15 min. Luego, poco a poco rehidratar con agua mediante la eliminación de la mitad de la solución de etanol a partir de la jarra y su sustitución por ddH 2 O. Incubar durante 5 min. Repetir 3 veces. Por otra parte, el uso del 70% - 35% - 15% - baños de etanol y agua durante 5 minutos cada uno. </li><li> Enjuague con agua destilada durante 5 minutos. </li><li> Mancha de carmín alumbre en la noche a temperatura ambiente. Cabe señalar que la tinción puede tomar más tiempo, dependiendo del grosor de la glándula. </li><li> Quitar manchas de carmín alumbre a la reutilización y poco a poco se deshidratan tejidos teñidos a través de baños de etanol de serie (50%, 70%, 95%, 100%) durante 5 minutos cada uno y aclarar en xileno, o en una alternativa no tóxica, como Histo-claro, durante la noche. Tanto la deshidratación y la limpieza también se puede requerir más tiempo incubaciones con muestras más gruesas. </li><li> Glándula mamaria sumergirse en salicilato de metilo. Las glándulas mamarias se puede mantener en salicilato de metilo en una campana de extracción hasta que las imágenes están listas para tomar. </li><li> Las imágenes pueden ser tomadas en una campana de humos con una cámara normal digital, colocada en un trípode (uso de &quot;macro&quot; función de si está disponible), mediante la colocación de las diapositivas en una mesa de luz. Utilizar un microscopio de disección de un aumento mayor. Por otra parte, las glándulas mamarias se puede montar en los medios de comunicación como Permount (después del paso 2.7) que permite imágenes que deben tomarse fuera una campana para sustancias químicas en cualquier plataforma de imágenes proporciona las monturas son lo suficientemente delgada. </li><li> Con el fin de cuantificar el desarrollo de la glándula mamaria con montaje en general, medidas tales como el número de ramificaciones (o ramas laterales) a lo largo de porciones de los conductos, la longitud de los conductos principales, o sea una proporción de células epiteliales a la zona de tejido adiposo podrían ser evaluados. Finalmente, después de documentación fotográficación, montaje de toda la glándula mamaria puede ser embebido en parafina para el corte y tinción histológica convencional. </li></ol> 3. Inducidas por la oxitocina de eyección de leche <ol><li> Separar las crías de la madre justo después de que han sido alimentados. Espere una hora antes de realizar el ensayo. </li><li> Sacrificio de la madre y exponer las glándulas mamarias como se describió anteriormente (pasos 1,1 a 1,8), sin necesidad de sacarlos de los animales. </li><li> Iniciar el ensayo de caída uniformemente PBS o la solución de oxitocina directamente en la glándula mamaria de interés, utilizando una pipeta de transferencia. Un amplio espectro de dosis se puede utilizar; ~ 8 pg / ml (dosis fisiológicas) se utiliza normalmente. Sin embargo, la alta dosis no fisiológica (hasta 1 mg / ml) se puede utilizar para garantizar la ausencia de respuesta en modelos de ratón modificados genéticamente. Para este procedimiento, se recomienda el uso de tórax (# 2-3) glándulas, utilizando un lado como un control (en contacto con PBS) y el otro lado para poner a prueba la eyección de leche (la exposición de oxitocina). </li><li> Incubar durante 1 minuto y retirar la solución cuidadosamente aspiración con una pipeta de transferencia. Entrada de la leche en los conductos se puede controlar mediante la grabación de cintas de vídeo, o por la toma de imágenes antes y después de la exposición PBS o la oxitocina. </li></ol> 4. Los resultados representativos: En un montaje de todo bien, la glándula mamaria está bien extendido y epitelio de los conductos son fácilmente observables (Figura 2A). Si la glándula no es muy extendido, que puede levantar en parte o totalmente de la diapositiva cuando se coloca en la solución fijadora. La glándula se convertirá en duro e inutilizable (Figura 2B). Del mismo modo, si la glándula no está bien diseccionado, ya sea una parte del epitelio pueden estar ausentes (Figura 2C) o resto de las partes de la piel o el músculo abdominal puede interferir con el análisis de la glándula (Figura 2). Para el ensayo de la oxitocina, es importante separar las crías lactantes de la presa por la misma cantidad de tiempo en cada ocasión. De esta manera, usted se asegurará de que ninguna leche o pequeñas cantidades de leche está presente en los conductos antes de la exposición de oxitocina, pero también que suficiente leche está presente en los alvéolos que se puede expulsar a los conductos por las contracciones mioepiteliales (Figura 3) . Si los cachorros se retiran demasiado pronto, la leche puede acumularse en los alvéolos y en los conductos de la representación del efecto de la oxitocina difícil de controlar (Figura 3B). Alternativamente, si el experimento se realiza demasiado pronto después de la eliminación crías, la leche no tendrá tiempo para acumularse en los alvéolos y la oxitocina inducida por las contracciones de las células mioepiteliales no provocar la liberación de suficiente cantidad de leche en los conductos que se observó (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Disección de la glándula mamaria del ratón. Pin con el ratón sobre la espalda de las cuatro extremidades (A). Cortar la piel en primer lugar desde el vientre hasta el cuello. A continuación, hacer incisiones perpendiculares del centro de la barriga a cada miembro, como se muestra en la línea de puntos (B). Con cuidado, vaya de la piel en el lado de los animales y el pin, la exposición de las glándulas mamarias (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Glándula mamaria del ratón montar todo. Conductos de epitelio (flechas) y los ganglios linfáticos (cabeza de flecha) se observan con facilidad en un montaje de la glándula mamaria todo bien propagación de la glándula # 4 (A). Una glándula mamaria mal extendido pueden desprenderse de la diapositiva y se derrumbó, éste no podrá utilizarse (B). De la glándula mamaria o bien eliminado incorrectamente puede tener partes que faltan (C) o trozos de músculo o la piel restante (D). Tenga en cuenta que la 2 ª y 3 ª tienen glándulas interdigitados muscular, pero todavía se puede utilizar para todo el montaje o la histología. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Oxitocina inducida por la eyección de leche se puede observar en los conductos del epitelio (flechas) después de la exposición de oxitocina (A). Sin embargo, si los conductos ya están llenos de leche (flechas) en el comienzo de la prueba debido a un período de latencia inapropiada después de la última amamantamiento de las crías, una mayor acumulación de leche en los conductos (flechas) después de la exposición oxitocina es difícil observar (B). Por otra parte, un período de latencia corto después de las crías lactantes no permitir la acumulación suficiente de leche en los alvéolos para ser debidamente observada en los conductos (flechas) después de la exposición de oxitocina (C). Las imágenes fueron tomadas antes y después de la exposición de oxitocina con una cámara numérica (Cybershot, Sony). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Representaciones esquemáticas de los ensayos de tratamiento de todo el montaje y la oxitocina.

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Desarrollo de la glándula mamaria y la función están muy orquestada. Los ratones mutantes pueden albergar las mutaciones genéticas que pueden afectar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de resaltar la necesidad de evaluar la arquitectura glándula 13,12. Montaje de todo se puede realizar como se describe en este artículo en todas las etapas de desarrollo de la glándula mamaria. Normalmente, el desarrollo del epitelio se aprecia en el comienzo de la pubertad (~ 4 semanas de edad), en el c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Carmín </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> De aluminio sulfato de potasio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> Timol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> Salicilato de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> La oxitocina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

evaluation of mammary gland development and function in mouse models

La glándula mamaria humana se compone de lóbulos 15-20 que secretan la leche en un sistema de apertura de ramificación del conducto en el pezón. Los lóbulos se compone de un número de unidades del terminal del conducto lobular hecho de los alvéolos secretores y conductos de convergencia 1. En ratones, una arquitectura similar se observa en el embarazo en la que los conductos y los alvéolos se intercalan en el estroma del tejido conjuntivo. El epitelio de la glándula mamaria del ratón es un árbol como el sistema de conductos compuesto por dos capas de células, una capa interna de células luminales rodeado por una capa externa de células mioepiteliales denotada por los confines de una membrana basal 2. Al nacer, sólo un árbol ductal rudimentario está presente, compuesto por un conducto de las ramas primarias y 15-20. Rama de elongación y empezar de amplificación en el comienzo de la pubertad, alrededor de 4 semanas de edad, bajo la influencia de las hormonas 3,4,5. A las 10 semanas, la mayoría de la estroma es invadido por un complejo sistema de conductos que se someten a ciclos de ramificación y de regresión en cada ciclo estral hasta el embarazo 2. En el inicio del embarazo, una segunda fase de desarrollo se inicia, con la proliferación y diferenciación del epitelio de uva para formar estructuras en forma de secreción de leche, llamados alvéolos 6,7. Siguientes al parto y durante la lactancia, la leche es producida por las células secretoras luminal y se almacena en el lumen de los alvéolos. La liberación de oxitocina, estimulada por un reflejo neural inducida por la lactancia de las crías, induce contracciones sincronizadas de las células mioepiteliales alrededor de los alvéolos y por los conductos, permitiendo que la leche que se transporta a través de los conductos hacia el pezón, donde esté disponible a los 8 cachorros. Desarrollo de la glándula mamaria, diferenciación y función están fuertemente orquestado y que requieren, no sólo las interacciones entre el estroma y el epitelio, sino también entre las células mioepiteliales y luminal del epitelio 9,10,11. Por lo tanto, las mutaciones en muchos genes implicados en estas interacciones pueden afectar tanto el alargamiento ductal durante la formación de la pubertad o los alvéolos durante el embarazo temprano, la diferenciación durante la última etapa del embarazo y la activación secretora que conduce a la lactancia 12,13. En este artículo se describe cómo diseccionar las glándulas mamarias de ratón y evaluar su desarrollo el uso de bases conjunto. También demostramos cómo evaluar las contracciones mioepiteliales y eyección de la leche con un ex-vivo oxitocina basado en análisis funcional. El efecto de una mutación genética en el desarrollo de la glándula mamaria y la función de lo que se puede determinar in situ mediante la realización de estas dos técnicas en el control de ratones mutantes y de tipo salvaje.

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Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.0K vistas.  University of Western Ontario. Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

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In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Investigación

Biología

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Los cambios en la morfología de la glándula mamaria y el riesgo de cáncer de mama en ratas

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...