Questi studi sono stati finanziati dalla CIHR e sovvenzioni per CBCRA DWL. IP è stato finanziato da borse di studio da CIHR-STP, FRSQ e CIHR. MKGS è stato finanziato da borse di studio e OGS CIHR-STP. Gli autori ringraziano Kevin Barr per la sua assistenza con l&#39;allevamento del mouse.

1. Dissezione della ghiandola mammaria <ol><li> Euthanize il mouse utilizzando CO 2 inalazione. Evitare dislocazione cervicale, se possibile, in quanto può danneggiare i vasi sanguigni del collo e provocare l&#39;accumulo di sangue intorno ghiandole mammarie, rendendo più difficile la dissezione. Tuttavia, se gli altri criteri sono da valutare nel topo lo stesso, quali i livelli di ossitocina nel sangue, i metodi di eutanasia alternativa può essere necessario, anche se ciò deve essere valutato dal IACUC. </li><li> Su un polistirene espanso avvolto in un foglio, posizionare il mouse sul dorso e diffuse ai quattro arti. Pin con fermezza tutti e quattro gli arti con 16-20 aghi calibro (Figura 1A). </li><li> Spruzzare generosamente il mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale sulla linea mediana e fare una piccola incisione con forbici affilate. </li><li> A partire dall&#39;incisione, tagliare la pelle fino al collo dell&#39;animale, evitando pungere la cavità addominale e toracica (Figura 1B). </li><li> Tagliare la pelle sulle zampe anteriori per l&#39;incisione sulla linea mediana, con conseguente &quot;forma Y&quot; (Figura 1B). Tagliare la pelle sugli arti posteriori allo stesso modo (Figura 1B). </li><li> Utilizzando pinze emostatiche, buccia delicatamente la pelle addominale e toracica al lato del mouse. Se necessario, tagliare delicatamente tessuto connettivo. </li><li> Fissare la pelle al polistirolo espanso con 16-20 aghi calibro, esponendo le ghiandole mammarie attaccato alla parte inferiore della pelle. Procedere e completare un lato alla volta (Figura 1C). </li><li> Con le pinzette e sollevare delicatamente la ghiandola mammaria di interesse e tagliare tra la ghiandola e la pelle con piccole forbici affilate, a partire dall&#39;esterno verso la colonna vertebrale dell&#39;animale. Assicurati di tagliare con attenzione, quindi non pezzi di pelle o dei muscoli rimangono sulla ghiandola. Tutte le ghiandole mammarie (Figura 1) può essere rimosso utilizzando questo protocollo, ma addominale ghiandole mammarie (# 4) sono i migliori per il montaggio intero. Il 2 ° e 3 ° ghiandole sono alcuni muscoli interdigitati e mentre possono essere usati per montare tutto e istologia, potrebbero non essere appropriati per tutte le analisi. </li></ol> 2. Intero monte <ol><li> Almeno un giorno prima della dissezione, preparare una soluzione di allume carminio sciogliendo 1 g di carminio e di 2.5g di solfato di alluminio, potassio in 500 ml di acqua distillata e fate bollire per 20 minuti in un pallone di Erlenmeyer 1 litro. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua. Filtrare attraverso carta Whatman e aggiungere una piccola quantità di timolo (alcuni grani) come conservante. Conservare in frigorifero. Dopo la colorazione, la soluzione di allume carminio può essere versato di nuovo alla bottiglia fotografici e riutilizzato più volte nell&#39;arco di diverse settimane. Fare una soluzione fresca quando il colore diventa debole. </li><li> Dopo ablazione della ghiandola mammaria dal mouse (fase 1), si è diffuso direttamente su un vetrino. Cercare di appiattire il più possibile, mantenendo la forma originale in situ. La ghiandola che si attacchi sul vetrino bene se correttamente allungati. </li><li> Fissare la ghiandola immergendolo, sul vetrino, in fissativo Carnoy (100% EtOH, cloroformio, acido acetico glaciale; 06:03:01) per 4 ore in cappa a temperatura ambiente in un barattolo. Da notare che altri ricercatori hanno utilizzato due ore che sembra essere sufficiente. In alternativa, le ghiandole possono anche essere fissato a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare in etanolo al 70% per 15 min. Poi, a poco a poco reidratare in acqua, eliminando metà della soluzione di etanolo dal vaso e la sua sostituzione con DDH 2 O. Incubare per 5 min. Ripetere 3 volte. In alternativa, utilizzare il 70% - 35% - 15% - bagni di etanolo e acqua per 5 minuti ciascuno. </li><li> Sciacquare con acqua distillata per 5 minuti. </li><li> Colorare con allume carminio notte a temperatura ambiente. Va notato che la colorazione potrebbe richiedere più tempo a seconda dello spessore della ghiandola. </li><li> Rimuovere allume carminio macchia di riutilizzare e gradualmente disidratano i tessuti colorati con bagni di etanolo seriale (50%, 70%, 95%, 100%) per 5 minuti ciascuno e chiaro in xilene, o in un non-tossico alternative come Histo-chiaro, durante la notte. Sia la disidratazione e di compensazione, potrebbero richiedere più incubazione con i campioni più spessi. </li><li> Immergere ghiandola mammaria in salicilato di metile. Ghiandole mammarie possono essere tenuti in salicilato di metile in una cappa aspirante fino a quando le immagini sono pronte per essere adottate. </li><li> Le immagini possono essere prese in una cappa con una normale fotocamera digitale posizionata su un treppiede (utilizzare la funzione &quot;macro&quot; se disponibile), ponendo i vetrini su un tavolo luminoso. Utilizzare un microscopio da dissezione per una maggiore ingrandimento. In alternativa, ghiandole mammarie possono essere montati in supporti come Permount (dopo il punto 2.7) che consente per le immagini da prendere all&#39;esterno di una cappa su qualsiasi piattaforma di imaging che fornisce i supporti sono sufficientemente sottili. </li><li> Al fine di quantificare lo sviluppo della ghiandola mammaria utilizzando montare tutto, misure come il numero di ramificazioni (o rami collaterali) lungo porzioni dei condotti, la lunghezza dei condotti primari, o un rapporto di epiteliali di superficie del tessuto adiposo può essere valutato. Infine, dopo documentazione fotograficazione, montare tutta la ghiandola mammaria possono essere inclusi in paraffina per sezionamento e tradizionale colorazione istologica. </li></ol> 3. Indotte da ossitocina latte espulsione <ol><li> Separare i cuccioli dalla madre solo dopo che sono stati nutriti. Attendere 1 ora prima di eseguire il test. </li><li> Il sacrificio della madre ed esporre le ghiandole mammarie, come descritto prima (passi 1,1-1,8), senza rimuoverli dall&#39;animale. </li><li> Iniziare l&#39;analisi di cadere in modo uniforme sia PBS o la soluzione di ossitocina direttamente sulla ghiandola mammaria di interesse, utilizzando una pipetta di trasferimento. Un ampio spettro di dosi può essere utilizzato; ~ 8 pg / ml (dose fisiologica) viene utilizzato in genere. Tuttavia, l&#39;alta non fisiologica dosi (fino a 1 mg / ml) può essere utilizzato per garantire l&#39;assenza di risposta in modelli di topo geneticamente modificati. Per questa procedura, si consiglia di utilizzare toracica (# 2-3) ghiandole, utilizzando un lato come un controllo (esposto a PBS) e l&#39;altro lato per testare emissione del latte (esposizione ossitocina). </li><li> Incubare per 1 minuto e rimuovere la soluzione con attenzione lo aspirazione con una pipetta di trasferimento. Ingresso latte nei dotti può essere monitorato da registrazione video su nastro, o prendendo le immagini prima e dopo l&#39;esposizione PBS o ossitocina. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In un montaggio buon complesso, la ghiandola mammaria è ben diffuso e condotti epitelio sono facilmente osservabili (Figura 2A). Se la ghiandola non è ben diffusa, può sollevare in parte o totalmente dalla diapositiva, quando sono immessi nella soluzione di fissativo. La ghiandola sarà quindi difficile e inutilizzabile (Figura 2B). Allo stesso modo, se la ghiandola non è ben sezionato, sia una parte dell&#39;epitelio può mancare (Figura 2C) o ancora parti della pelle o dei muscoli addominali interferirà con l&#39;analisi della ghiandola (Figura 2D). Per l&#39;analisi ossitocina, è importante separare i cuccioli da latte dalla diga per la stessa quantità di tempo in ogni occasione. In questo modo, si farà in modo che nessun latte o piccole quantità di latte è presente nei condotti prima dell&#39;esposizione ossitocina, ma anche che il latte a sufficienza è presente negli alveoli che possono essere espulso nei dotti da contrazioni mioepiteliali (Figura 3A) . Se i cuccioli vengono rimosse troppo presto, il latte può accumularsi negli alveoli e dei dotti rendere l&#39;effetto di difficile ossitocina per monitor (Figura 3B). In alternativa, se l&#39;esperimento viene effettuato troppo presto dopo la rimozione del cucciolo, il latte non avrà il tempo di accumulare negli alveoli e indotte da ossitocina le contrazioni delle cellule mioepiteliali non innescare rilascio abbastanza latte nei dotti da osservare (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Dissezione della ghiandola mammaria mouse. Pin con il mouse sul dorso dai quattro arti (A). Tagliare la prima pelle dalla pancia al collo. Poi fare incisioni perpendicolare dal centro del ventre per ogni arto, come mostrato dalla linea tratteggiata (B). Buccia delicatamente la pelle sul lato dell&#39;animale e lo spillo, esponendo le ghiandole mammarie (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Mouse ghiandola mammaria monte tutto. Condotti epitelio (frecce) e il linfonodo (punta di freccia) sono facilmente osservabili in un montaggio ben diffuso della ghiandola mammaria intera ghiandola # 4 (A). Una ghiandola mammaria scarsamente diffuse possono staccarsi dalla diapositiva e crollò, rendendolo inutilizzabile (B). Una ghiandola mammaria impropriamente asportato possono avere parti mancanti (C) o pezzi di muscolo o della pelle residua (D). Si noti che il 2 ° e 3 ° ghiandole hanno interdigitati muscolare, ma può ancora essere utilizzato per intero il montaggio o istologia. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Indotte da ossitocina emissione del latte può essere osservato nei condotti epitelio (frecce) a seguito di esposizione ossitocina (A). Tuttavia, se condotti sono già pieni di latte (frecce) all&#39;inizio del test a causa di un lungo periodo di latenza impropriamente dopo l&#39;ultima allattamento dei cuccioli, un ulteriore accumulo di latte nei dotti (frecce) dopo l&#39;esposizione ossitocina è difficile da osservare (B). In alternativa, un periodo di latenza breve dopo allattamento cucciolo non consentirà l&#39;accumulo sufficiente di latte negli alveoli di essere adeguatamente osservati nei condotti (frecce) dopo l&#39;esposizione ossitocina (C). Le immagini sono state scattate prima e dopo l&#39;esposizione ossitocina usando una macchina fotografica numerica (Cybershot, Sony). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Rappresentazione schematica del tutto saggi trattamento di montaggio e l&#39;ossitocina.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione sono strettamente orchestrata. Topi mutanti possono ospitare le mutazioni del gene che può alterare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione evidenziando la necessità di valutare l&#39;architettura della ghiandola 13,12. Montaggio intero può essere eseguita come descritto in questo articolo in tutte le fasi di sviluppo della ghiandola mammaria. Tipicamente, lo sviluppo del epitelio è valutata all&#39;inizio della pubertà (~ 4 settimane), nel bel m...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Carminio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> Potassio, solfato di alluminio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> Timolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> Salicilato di metile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> L&#39;ossitocina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

evaluation of mammary gland development and function in mouse models

La ghiandola mammaria umano è composto da 15-20 lobi, che secernono il latte in una ramificazione del sistema di apertura del condotto al capezzolo. Quelli lobi sono a loro volta composte di un numero di unità terminali del condotto lobulare in alveoli secretoria e condotti convergenti 1. Nei topi, un&#39;architettura simile è stato osservato in gravidanza in cui si alternano dotti e degli alveoli nello stroma del tessuto connettivo. L&#39;epitelio della ghiandola mammaria mouse è un albero come sistema di condotti composto da due strati di cellule, uno strato interno di cellule luminali circondato da uno strato esterno di cellule mioepiteliali indicato con i confini di una membrana basale 2. Alla nascita, solo un albero duttale rudimentale è presente, composto da un condotto di rami primari e 15-20. Filiale di allungamento e iniziare amplificazione all&#39;inizio della pubertà, circa 4 settimane, sotto l&#39;influenza degli ormoni 3,4,5. A 10 settimane, la maggior parte dello stroma è invasa da un complesso sistema di canali che saranno sottoposti a cicli di ramificazione e di regressione di ogni ciclo estrale fino a quando la gravidanza 2. All&#39;inizio della gravidanza, una seconda fase di sviluppo inizia, con la proliferazione e la differenziazione dell&#39;epitelio a formare strutture a forma di uva secretoria latte chiamati alveoli 6,7. A seguito di parto e durante l&#39;allattamento, il latte è prodotto dalle cellule secretorie luminale e conservati all&#39;interno del lume degli alveoli. L&#39;ossitocina rilascio, stimolato da un riflesso neurale indotta da latte di cuccioli, induce contrazioni sincronizzata delle cellule mioepiteliali intorno agli alveoli e lungo i condotti, permettendo il latte deve essere trasportato attraverso i condotti al capezzolo dove diventa disponibile per i cuccioli 8. Lo sviluppo della ghiandola mammaria, la differenziazione e la funzione sono strettamente orchestrata e richiedono, non solo le interazioni tra lo stroma e l&#39;epitelio, ma anche tra le cellule mioepiteliali e luminale all&#39;interno dell&#39;epitelio 9,10,11. In tal modo, le mutazioni in molti geni implicati in queste interazioni possono compromettere sia l&#39;allungamento duttale durante la pubertà o la formazione di alveoli durante la gravidanza iniziale, differenziazione durante la gravidanza e l&#39;attivazione secretoria porta alla lattazione 12,13. In questo articolo viene descritto come analizzare ghiandole mammarie del mouse e valutare il loro sviluppo utilizzando supporti interi. Abbiamo anche dimostrare come valutare le contrazioni mioepiteliali e l&#39;espulsione del latte con un ex-vivo a base di ossitocina test funzionali. L&#39;effetto di una mutazione del gene per lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione può quindi essere determinata in situ con l&#39;esecuzione di queste due tecniche di controllo nei topi mutanti e wild-type.

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Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Questo metodo viene illustrato come analizzare e valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione da topi. Escisse ghiandole mammarie sono valutati per il grado di sviluppo utilizzando montare tutto mentre emissione del latte viene valutata utilizzando un ossitocina a base di test contrazione delle cellule mioepiteliali.

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Views.  University of Western Ontario. Questo metodo viene illustrato come analizzare e valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione da topi. Escisse ghiandole mammarie sono valutati per il grado di sviluppo utilizzando montare tutto mentre emissione del latte viene valutata utilizzando un ossitocina a base di test contrazione delle cellule mioepiteliali.

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In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Ricerca

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Cambiamenti nella morfologia della ghiandola mammaria e rischio di cancro al seno in topi

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...