Estes estudos foram financiados pelo CIHR e subvenções CBCRA para DWL. IP foi financiado por bolsas de CIHR-STP, FRSQ e CIHR. MKGS foi financiado por bolsas de estudo e OGS CIHR-STP. Os autores agradecem Kevin Barr por sua assistência com a criação do mouse.

1. Dissecção da glândula mamária <ol><li> Euthanize o mouse usando CO 2 por inalação. Evitar o deslocamento cervical, se possível, uma vez que pode danificar os vasos sanguíneos principais no pescoço e resultam em acúmulo de sangue em torno de glândulas mamárias, tornando a dissecção mais difícil. No entanto, se outros critérios devem ser avaliados no mesmo mouse, tais como os níveis sanguíneos de oxitocina, métodos de eutanásia alternativa pode ser necessária, mas isso deve ser avaliado pelo seu IACUC. </li><li> Em uma espuma de poliestireno envolto em papel alumínio, coloque o mouse sobre as suas costas e se espalhou nos quatro membros. Pin firmemente todos os quatro membros com 16-20 agulhas (Figura 1A). </li><li> Pulverizar o mouse generosamente com etanol 70%. </li><li> Utilizando uma pinça, puxe a pele abdominal na linha média e fazer uma pequena incisão com uma tesoura afiada. </li><li> A partir da incisão, corte a pele até o pescoço do animal, evitando a punção da cavidade abdominal ou torácica (Figura 1B). </li><li> Cortar a pele nas pernas da frente para a incisão na linha média, resultando em uma &quot;forma Y&quot; (Figura 1B). Cortar a pele nos membros traseiros da mesma maneira (Figura 1B). </li><li> Utilizando uma pinça hemostática, descascar delicadamente a pele abdominal e torácica para o lado do mouse. Se necessário, cortar delicadamente tecido conjuntivo. </li><li> Corrigir a pele para a espuma de poliestireno utilizando 16-20 agulhas, expondo as glândulas mamárias acoplada à parte inferior da pele. Prosseguir e completar um lado de cada vez (Figura 1C). </li><li> Utilizando uma pinça, levante cuidadosamente a glândula mamária de juros e corte entre a glândula ea pele com pequenas tesoura afiada, começando a partir do exterior para a coluna vertebral do animal. Certifique-se de cortar com cuidado, para não pedaços de pele ou do músculo permanecer na glândula. Todas as glândulas mamárias (Figura 1) pode ser removido usando este protocolo, mas abdominal glândulas mamárias (# 4) são os melhores para a montagem de todo. A 2 ª e 3 ª glândulas têm alguns músculos interdigitados e enquanto eles podem ser usados ​​para montar todo e histologia, eles podem não ser apropriados para todas as análises. </li></ol> 2. Montar toda <ol><li> Pelo menos, um dia antes da dissecção, prepare carmim solução alum dissolvendo 1g de carmim e 2,5 g de sulfato de alumínio de potássio em 500 ml de água destilada e ferver durante 20 minutos em um Erlenmeyer de 1 litro. Ajustar o volume final de 500 ml com água. Filtrar por papel Whatman e adicionar uma pequena quantidade de timol (poucos grãos) como conservante. Leve à geladeira. Após a coloração, carmim alum solução pode ser despejada de volta para a garrafa de ações e reutilizados várias vezes durante várias semanas. Faça uma nova solução quando a cor se torna fraco. </li><li> Após excisão da glândula mamária do mouse (passo 1), espalhe-o diretamente sobre uma lâmina de vidro. Tente alise-o, tanto quanto possível, mantendo o original na forma in situ. A glândula vai ficar muito bem no slide quando devidamente esticada. </li><li> Corrigir a glândula mergulhando-o, no slide, em fixador de Carnoy (100% EtOH, clorofórmio, ácido acético glacial; 06:03:01) por 4 horas na capela à temperatura ambiente em um frasco. Note-se que outros autores utilizaram duas horas que parece ser suficiente. Alternativamente, as glândulas também pode ser fixado em 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar em etanol 70% por 15 min. Então, gradualmente reidratar em água através da remoção de metade da solução de etanol a partir do jar e substituindo-o DDH 2 O. Incubar por 5 min. Repita 3 vezes. Como alternativa, use 70% -, 35% -, 15% - banhos de etanol e água por 5 minutos cada. </li><li> Enxágüe em água destilada por 5 minutos. </li><li> Mancha em alum carmim durante a noite a temperatura ambiente. Note-se que a coloração pode demorar mais dependendo da espessura da glândula. </li><li> Remova a mancha carmim alum para reutilizar e, gradualmente, desidratar o tecido manchado através de banhos de etanol de série (50%, 70%, 95%, 100%) por 5 min cada um e claro em xileno, ou em uma alternativa não-tóxica, como Histo-clara, durante a noite. Ambos desidratação e limpeza também pode exigir mais incubações com amostras mais espessas. </li><li> Glândula mamária mergulhe em salicilato de metila. Glândulas mamárias podem ser mantidos em salicilato de metila em uma capela até imagens estão prontas para serem tomadas. </li><li> As imagens podem ser tomadas em uma capela com uma câmera digital comum posicionada sobre um tripé (use a função &quot;macro&quot; se disponível), colocando as lâminas sobre uma mesa de luz. Use um microscópio de dissecação para maior ampliação. Alternativamente, glândulas mamárias pode ser montado em mídia, como Permount (após o passo 2.7) permitindo imagens a serem tomadas fora de uma Cobertura de vapores químicos em qualquer plataforma de imagem fornecendo as montagens são suficientemente fina. </li><li> A fim de quantificar o desenvolvimento da glândula mamária usando montar todo, medidas tais como o número de ramificações (ou ramos laterais) ao longo de trechos dos dutos, o comprimento dos dutos primários, ou um rácio de epiteliais para a área de tecido adiposo pode ser avaliada. Finalmente, depois de documentação fotográficação, montar toda glândula mamária pode ser incluído em parafina para corte e coloração histológica convencional. </li></ol> 3. Ocitocina induzida pela ejeção do leite <ol><li> Separar os filhotes da barragem só depois de terem sido alimentados. Esperar 1 hora antes da realização do ensaio. </li><li> Sacrifício da mãe e expor as glândulas mamárias como descrito anteriormente (passos 1,1-1,8), sem removê-las do animal. </li><li> Inicie a análise por uniformemente caindo tanto PBS ou a solução de oxitocina diretamente na glândula mamária de interesse, utilizando uma pipeta de transferência. Um amplo espectro de doses podem ser usadas; ~ 8 pg / ml (dose fisiológica) é normalmente usado. No entanto, alta não-fisiológicos doses (até 1 mg / ml) pode ser usado para garantir a ausência de resposta em modelos de ratos geneticamente modificados. Para este procedimento, é recomendado o uso torácica (# 2-3) glândulas, usando um lado como um controle (expostos a PBS) e do outro lado para testar ejeção do leite (exposição oxitocina). </li><li> Incubar por 1 minuto e retire a solução com cuidado a aspiração com uma pipeta. Entrada de leite dentro dos ductos pode ser monitorado por gravação de fita de vídeo, ou ao tomar imagens antes e após a exposição PBS ou ocitocina. </li></ol> 4. Resultados representativos: Em uma montagem toda boa, a glândula mamária está muito bem distribuídos e os dutos são facilmente observáveis ​​epitélio (Figura 2A). Se a glândula não é bem-spread, ele pode levantar, em parte ou totalmente a partir do slide quando colocados na solução fixadora. A glândula, então, tornam-se duras e inutilizável (Figura 2B). Da mesma forma, se a glândula não é bem dissecada, ou alguma parte do epitélio pode estar ausente (Figura 2C) ou restantes partes da pele ou do músculo abdominal irá interferir com a análise da glândula (Figura 2D). Para o ensaio de oxitocina, que é importante para separar os filhotes de sucção da barragem para a mesma quantidade de tempo em todas as ocasiões. Desta forma, você vai ter certeza que nenhum leite ou pequenas quantidades de leite está presente nos dutos antes da exposição a ocitocina, mas também que o leite o suficiente está presente nos alvéolos, que pode ser ejetado para os dutos por contrações mioepiteliais (Figura 3A) . Se os filhotes são retirados muito cedo, o leite pode se acumular nos alvéolos e nos dutos tornando o efeito da oxitocina difícil monitor (Figura 3B). Alternativamente, se o experimento é realizado muito cedo após a remoção das crias, o leite não terá tempo para acumular nos alvéolos e ocitocina induzida por contrações das células mioepiteliais não vai desencadear a liberação de leite suficiente para as condutas a serem observadas (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Rato dissecção da glândula mamária. Pin o mouse sobre as suas costas por quatro membros (A). Corte a pele em primeiro lugar da barriga ao pescoço. Em seguida, fazer incisões perpendicular do centro do ventre para cada membro, como mostrado pela linha pontilhada (B). Descascar delicadamente a pele do lado do animal e fixá-lo, expondo as glândulas mamárias (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Rato montar toda glândula mamária. Dutos de epitélio (setas) e os linfonodos (seta) são facilmente observados em uma montagem muito bem glândula mamária espalhar toda a glândula # 4 (A). A glândula mamária pode se espalhar mal que se destaquem do slide e desabou, deixando-o inacessível (B). Uma glândula mamária inadequadamente excisadas pode ter partes em falta (C) ou pedaços de músculo ou pele restante (D). Note-se que as glândulas de 2 º e 3 º têm interdigitados muscular, mas ainda pode ser usado para montar todo ou histologia. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Ocitocina induzida pela ejeção do leite pode ser observado em dutos epitélio (setas) após a exposição a ocitocina (A). No entanto, se ductos já estão preenchidos com leite (setas) no início do ensaio, devido a um período longo de latência de forma inadequada após a última mamada dos filhotes, mais acumulação de leite nos ductos (setas) após a exposição a oxitocina é difícil observar (B). Alternativamente, um período de latência curto após mamar filhote não vai permitir que o suficiente para o acúmulo de leite nos alvéolos de ser devidamente observada nos dutos (setas) após exposição a ocitocina (C). Imagens foram tiradas antes e depois da oxitocina exposição usando uma câmera numérica (Cybershot, da Sony). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Representações esquemáticas de todo ensaios de tratamento de montagem e ocitocina.

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M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calcium+on+oxytocin-induced+contraction+of+mammary+gland+myoepithelium+as+visualized+by+NBD-phallacidin.">Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin.</a> J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Desenvolvimento da glândula mamária e função são bem orquestrado. Camundongos mutantes podem abrigar mutações genéticas que podem prejudicar o desenvolvimento da glândula mamária e função destacando a necessidade de avaliar a arquitetura da glândula 13,12. Montagem de todo pode ser realizada como descrito neste artigo em todas as fases de desenvolvimento da glândula mamária. Geralmente, o desenvolvimento do epitélio é avaliado no início da puberdade (~ 4 semanas de idade), no meio da puberda...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Carmim </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> Sulfato de potássio alumínio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> Timol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> Salicilato de metila </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> Oxitocina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

evaluation of mammary gland development and function in mouse models

A glândula mamária humana é composta de 15-20 lóbulos que secretam leite em um sistema de abertura de ramificação do ducto no mamilo. Os lobos são eles próprios composto por um número de unidades lobular terminal duto feito de alvéolos secretores e dutos convergentes 1. Em camundongos, uma arquitetura semelhante é observado na gestação em que ductos e alvéolos são intercalados dentro do estroma do tecido conjuntivo. O mouse epitélio da glândula mamária é uma árvore como sistema de dutos composto de duas camadas de células, uma camada interna de células luminais rodeado por uma camada externa de células mioepiteliais denotada pelos confins de uma membrana basal 2. Ao nascer, apenas uma árvore ductal rudimentar está presente, composto de um duto de ramos primários e 15-20. Alongamento ramo e começar a amplificação no início da puberdade, em torno de 4 semanas de idade, sob a influência de hormônios 3,4,5. Às 10 semanas, a maioria do estroma é invadida por um complexo sistema de dutos que passarão por ciclos de ramificação e de regressão em cada ciclo estral até que a gravidez 2. No início da gravidez, uma segunda fase de desenvolvimento começa, com a proliferação e diferenciação do epitélio de uva para formar estruturas em forma de leite secretoras chamadas alvéolos 6,7. Após o parto e durante a lactação, o leite é produzido por células secretoras luminal e armazenados dentro do lúmen dos alvéolos. Oxitocina lançamento, estimulada por um reflexo neural induzida pela amamentação dos filhotes, induz as contrações sincronizado das células mioepiteliais em torno dos alvéolos e ao longo dos canais, permitindo que o leite a ser transportado pelos dutos até o mamilo, onde se torna disponível para a 8 filhotes. Desenvolvimento da glândula mamária, diferenciação e função estão bem orquestrados e exigem, não só as interações entre o estroma eo epitélio, mas também entre as células mioepiteliais e dentro do epitélio luminal 9,10,11. Assim, mutações em muitos genes envolvidos nestas interações pode prejudicar tanto o alongamento ductal durante a puberdade ou alvéolos formação durante a gravidez precoce, a diferenciação no final da gravidez e ativação secretória levando a lactação 12,13. Neste artigo, descrevemos como dissecar as glândulas mamárias do mouse e avaliar o seu desenvolvimento usando monta todo. Também demonstramos como avaliar as contrações mioepiteliais e ejeção do leite através de um ex-vivo ensaio oxitocina baseado funcional. O efeito de uma mutação genética no desenvolvimento da glândula mamária e função pode assim ser determinada in situ através da realização de duas técnicas, em ratos controle mutante e do tipo selvagem.

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Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

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Research

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37.0K visualizações.  University of Western Ontario. Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Vídeo: Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Alterações na morfologia da glândula mamária e risco de câncer de mama em ratos

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...