1. Preparación del epitelio de Trasplantes Donantes de tejidos frescos o congelados epiteliales pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado, pero la preparación previa del epitelio donante congelado es más conveniente, con una mínima disminución en la eficacia del trasplante (eficiencia&gt; 85%). El protocolo para la preparación del epitelio donante congelado es el siguiente: Antes de preparar el epitelio de trasplantes, preparar los medios de congelación para el epitelio y la alícuota de 1 ml en crioviales. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses hasta que sea necesario. Congelar los medios de comunicación contiene DMEM/F12 los medios de comunicación tamponado con HEPES y NaHCO 3, 10% de suero fetal bovino (SFB) y el 10% dimetilsulfóxido (DMSO). Cosecha de epitelio mamario de una hembra de ratón recién sacrificado. <ol><li> Lavar el ratón con un 70% EtOH. </li><li> Haga un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón, sin perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. Haga un corte oblicuo de la incisión inicial en el pubis hacia cada pata trasera (Figura 1). </li><li> Pele la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas para exponer el 5 de glándula mamaria inguinal unido a la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo. La mejor manera de lograrlo es comprender las membranas serosas con cuidado con la parte curva de un par de pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar la cavidad ventral del cuerpo. Al mismo tiempo, sujete el borde del corte de la envoltura con la pinza dentada recta y tire de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas. </li><li> Identificar los ganglios linfáticos dentro de la glándula mamaria. El ganglio linfático se encuentra en la intersección de tres vasos sanguíneos prominentes en la glándula mamaria y se puede sentir como un nódulo denso dentro de la almohadilla de grasa (Figura 2). Con la punta de unas tijeras los ojos, cortar el tejido adiposo que rodea el nodo. Con un dedo índice en la parte epidérmica de la piel, aplique presión para sacar a los nodos de la capa de grasa y una pizca si fuera poco con un par de pinzas curvas. Deseche los ganglios linfáticos. </li><li> Mientras se mantiene al margen de la piel, sujete la almohadilla de grasa mamaria con el borde curvo de un par de pinzas curvas y poco a poco la cáscara de la almohadilla de grasa de la pared del cuerpo. Siga la dirección de la almohadilla de grasa hacia la superficie dorsal del ratón como se quita toda la glándula mamaria en una sola pieza. </li><li> Ponga la glándula mamaria en un bloque de plástico de corte estériles. Agregue una pequeña cantidad de medios de comunicación, cerca de 200 l, a la superficie de la glándula para mantenerlo húmedo. Picar la glándula en trozos de 1 mm con una cuchilla de afeitar nueva. Divide la glándula picada en cuatro partes y distribuir entre los cuatro crioviales de los medios de congelación con una pinza. Ponga el crioviales en un Nalgene &quot;congelador de células Mr. Frosty que 250 ml de alcohol isopropílico en el compartimento exterior. Poner en el congelador Nalgene en un congelador de -70 º C durante 24 horas. Guarde los frascos congelados de fragmentos de mama en nitrógeno líquido hasta que sea necesario para trasplante. Cada criovial contendrá fragmentos de la glándula mamaria suficiente para el trasplante en las almohadillas de grasa despejado de 4 a 8 ratones de acogida. </li></ol> 2. Preparación de las células de Trasplantes Nuestro laboratorio ha trasplantado diferentes tipos de células, incluyendo inmortalizado líneas de células epiteliales mamarias de mama líneas de células tumorales o células primarias de mama en un ratón despejado almohadilla de grasa. El protocolo para la preparación de Coma-D para el trasplante de células es el siguiente: <ol><li> Coma-D células se cultivan en los medios de comunicación regulares MECL contiene DMEM: F12 suplementado con Adulto 2% de suero bovino (ABS), mEGF, insulina, antibióticos / antimicóticos (AB / AM). </li><li> Cosecha D comas las células cuando las células son un 85% -90% confluente. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular a 1200rpm durante 5 minutos para que sedimenten las células. Resuspender las células en los medios de comunicación fresca MECL y ajustar la concentración de células a 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Para el trasplante de células primarias de mama, la primaria de las células epiteliales mamarias están aislados de ratón 5 de las glándulas mamarias a través de la disociación mecánica y enzimática. Las células se resuspendieron en DMEM: medio F12 y se ajusta a la concentración deseada, por lo general 5 x 10 6 ml /. 3. Procedimiento estándar para la limpieza del ratón almohadilla de grasa mamaria <ol><li> Anestesiar el ratón de tres semanas de acogida de edad. Seleccione los ratones que son &lt;12 g para asegurar que el crecimiento ductal de mama no se ha iniciado. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2-tribromoetanol. </li><li> Después de que el ratón está anestesiado, con firmeza limitar el ratón, la parte ventral con las extremidades extendidas, en un tiempo quirúrgico, para que el abdomen se burla. Antes de la cirugía, administrar analgésicos, ya sea bupivacaína (1mg/kg &lt;) o la buprenorfina (0.05mg/kg), por vía subcutánea. </li><li> Sujete la piel con pinzas de unos pocos milímetros por encima de la pelvis y levántela desde el abdomen<html> . Cortar la piel con unas tijeras y hacer un corte sagital medio a través de la pared del cuerpo que se extiende desde el pubis hasta el esternón. No perforar las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. No haga que su incisión inicial muy cerca de la uretra para que los clips de la herida no va a interferir con la capacidad del ratón para orinar. </li><li> De la incisión inicial, hacer cortes oblicuos a través de la piel de la línea media a través de la pelvis hacia cada pata trasera. </li><li> Utilice el área de la curva pinzas curvas para agarrar suavemente las membranas serosas. El uso de fórceps tejido de captar el margen de corte de la piel y tirar de la pared del cuerpo lejos de las membranas serosas y exponer el 5 de glándula mamaria inguinal situada en la fascia en la parte inferior de la pared del cuerpo. </li><li> Cauterizar el pezón, el nodo y dos arterias que van al nodo (Figura 2) </li><li> Separar las glándulas cuarto y quinto. Cauterizar el margen de la glándula quinto para prevenir el crecimiento interno de la glándula 6 ª. </li><li> Divide la almohadilla de grasa de la glándula mamaria cuarto cortando a través de la almohadilla de grasa con unas tijeras sólo ventral (lado hacia el pezón) del nodo. Use pinzas curvas para agarrar firmemente la porción ventral de la almohadilla de grasa y tire de ella fuera de la pared del cuerpo en una sola pieza. Presione la parte ventral de la capa de grasa entre dos diapositivas y poner en un recipiente de vidrio de tinción histológica que contiene el fijador de Carnoy. Este tejido se fijan y se tiñen después con solución de alumbre carmín para comprobar los márgenes de borrado (Figura 3). Limpie la fascia de la región de la porción eliminada de la almohadilla de grasa a eliminar todos los rastros de la glándula mamaria con las pinzas curvas. </li></ol> 4. Alternativa &quot;procedimiento que preserve para la limpieza del almohadilla de grasa Después se ha convertido en un competente con el procedimiento estándar para limpiar el ratón almohadilla de grasa mamaria, es posible que prefieran realizar los procedimientos de preservación menos invasivo desarrollado por Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Prepare el ratón como para el procedimiento estándar. </li><li> Sujete el pezón de la glándula mamaria inguinal cuarto y cortar un círculo de 3-5 mm circunferencia alrededor del pezón con la punta de unas tijeras. </li><li> Tire de la boquilla del cuerpo para separar la parte cortada de la piel y extraer la glándula mamaria inguinal cuarto por el agujero. </li><li> Identificar el nodo. Utilice el cauterio para cauterizar el nodo y la glándula mamaria 6 º a través del agujero. </li><li> Cortar y separar la parte más superficial de la glándula mamaria 5 º justo antes del nodo. Los pezones, la zona circular de la piel y la parte del epitelio de la almohadilla de grasa mamaria que contiene se eliminan en una sola pieza. </li></ol> 5. Tejido / Trasplante de células <ol><li> De los fragmentos de epitelio trasplante, descongelar un criovial del epitelio y la transferencia de los fragmentos epiteliales de una placa de Petri que contienen medio fresco para diluir el DMSO. Haz un pequeño agujero o en el bolsillo en la almohadilla de grasa despejó con la punta de tijera para el nuevo epitelio. Ponga un pedazo de 1 mm de epitelio de los donantes en el bolsillo con unas pinzas de aguja. Mantenga la bolsa cerrada con una pinza de tejidos al retirar la pinza de la aguja para que el tejido se mantiene en su lugar. </li><li> Para las células del trasplante, las células se inyectan 50.000 en 10 l de los medios de comunicación en cada capa de grasa con una jeringa Hamilton 50μl con una aguja de calibre 22s. </li></ol> 6. Cierre / Revival de ratón <ol><li> Organizar la piel para el cierre. Captar los márgenes opuestos de la piel, los mantienen unidos con unas pinzas, ascensor lejos de las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo y cerrar con clips de la herida. Por lo general, es necesario utilizar dos clips para cerrar la incisión sagital medio y un clip para cada incisión oblicua para el procedimiento estándar. Evitar la obstrucción de la uretra. Puede que sea necesario para cerrar las brechas en la piel en la intersección de las incisiones sagital oblicuo y con una sutura. El procedimiento que preserve sólo requerirá un clip de la herida para cada lado. </li><li> . Coloque el ratón en su jaula y mantener la jaula con una lámpara de calentamiento hasta que el ratón ha revivido. </li><li> Los clips de la herida debe ser retirado después de 2 semanas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Demostración de patrón de incisión. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ubicación de los ganglios linfáticos, los vasos sanguíneos, el pezón y el epitelio endógeno. Cauterizar en los lugares indicados. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Montaje de la figura 3. Todo demuestra que el epitelio endógeno se limita a la zona dentro del círculo y por lo tanto, los márgenes son &quot;claras&quot;. 7. Resultados representante _r.jpg &quot;alt =&quot; Figura 4 &quot;/&gt; Figura 4. Todo el montaje de la almohadilla de grasa eliminado de ratón de 3 semanas de edad mostrando los márgenes de borrado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestran las almohadillas de grasa limpia de epitelio mamario endógeno. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Hematoxilina y eosina sección de una almohadilla de grasa despejado de un ratón de 10 semanas de edad. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Todo el montaje de un ratón de 10 semanas de edad muestren un funcionamiento normal del árbol ductal mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Hematoxilina eosina y la sección de los conductos mamarios desarrollados a partir de epitelio trasplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Hematoxilina y eosina sección de un tumor mamario desarrollado a partir de epitelio trasplantado.

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	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

En este informe, se presentan dos métodos alternativos para la limpieza de la almohadilla de grasa mamaria de ratón en la preparación para los trasplantes de mama epiteliales. El procedimiento estándar ha estado en uso desde su desarrollo en 1959 por Enviaselo et al. 1 Mientras más invasivo, el método estándar es el método preferido para la formación de los principiantes, porque la estructura y la orientación de la glándula mamaria son fácilmente vistos. Sin embargo, el procedimiento que ...

mammary epithelial transplant procedure

En este artículo se describe y compara el procedimiento de autorización almohadilla grasa desarrollado por Enviaselo KB et al. 1 y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B et al. 2, seguido por el procedimiento de trasplante epiteliales mamarias. El procedimiento de trasplante de mama es ampliamente utilizado por los biólogos de mama, ya que se aprovecha del hecho de que un importante desarrollo del epitelio mamario no ocurre hasta después de la pubertad. A las 3 semanas de edad, el crecimiento del árbol epiteliales mamarias se limita a las cercanías del pezón y la almohadilla de grasa es en gran parte desprovista de epitelio mamario, pero por 7 semanas de edad del árbol epitelio ductal se extiende a lo largo de la almohadilla de grasa total. Por lo tanto, si esta pequeña porción de la almohadilla de grasa que contiene epitelio, la región entre el pezón y los ganglios linfáticos, se retira a las 3 semanas de edad, el epitelio endógeno nunca llenarán la almohadilla de grasa mamaria y la almohadilla de grasa que se describe como &quot;despejó &quot;. En este momento, el epitelio mamario de otra fuente pueden ser trasplantados en la almohadilla de grasa despejado en el que tiene el potencial para extender mama ductal árboles a través de la almohadilla de grasa. Este procedimiento ha sido utilizado en muchos modelos experimentales, incluyendo el examen del fenotipo tumoral en tejidos epiteliales mamarias transgénico sin los efectos de confusión del genotipo en el animal entero 3, en la identificación de células madre mamarias mediante el trasplante de células de la dilución 4,5 limitada, la determinación de si los nódulos hiperplásicos proceder a tumores mamarios 6, y para evaluar el efecto de la exposición hormonal previo sobre el comportamiento de el epitelio mamario 7,8. Tres semanas de edad, los ratones de acogida están anestesiados, limpia y contenida en una fase quirúrgica. Se hace una incisión sagital se realiza a través de la piel, pero no el peritoneo, que se extiende desde el pubis hasta el esternón. Cortes oblicuos se realizan a través de la piel de la incisión sagital a través de la pelvis hacia cada pierna. La piel se separa del peritoneo para exponer la cuarta glándula mamaria inguinal. La capa de grasa que se elimina mediante la eliminación de la anterior plataforma de tejido graso de los ganglios linfáticos. Fragmentos de epitelio o de las células epiteliales son trasplantadas en el resto de almohadilla de grasa y despejó el ratón está cerrado.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

En este artículo se muestra el procedimiento desarrollado por Enviaselo KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) para limpiar el cuarto inguinal almohadilla de grasa mamaria de un ratón de la pubertad en la preparación para el trasplante de fragmentos de mama, las células epiteliales mamarias, o las células mamarias tumorales.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K vistas.  University of Massachussetts. En este artículo se muestra el procedimiento desarrollado por Enviaselo KB Et al. (1959) y el procedimiento que preserve desarrollado por Brill B Et al. (2008) para limpiar el cuarto inguinal almohadilla de grasa mamaria de un ratón de la pubertad en la preparación para el trasplante de fragmentos de mama, las células epiteliales mamarias, o las células mamarias tumorales.

Video: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

La investigación de los mecanismos inmunológicos subyacentes rechazo de trasplante de órganos

Investigación

Biología

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Hemihepatectomía derecho por transección intrahepática suprahiliar del derecho Hemipedicle utilizando una grapadora vascular

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...