이러한 연구 CIHR와 DWL에 CBCRA의 보조금에 의해 투자되었다. IP는 CIHR - STP, FRSQ 및 CIHR에서 장학금으로 투자했다. MKGS는 OGS와 CIHR - STP 장학금에 의해 투자되었다. 저자는 마우스 번식과 함께 자신의 도움 케빈 바 주셔서 감사합니다.

1. 유선의 해부 <ol><li> CO 2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사. 그것은 절개가 더 어려워 렌더링, 내유 땀샘 주위에 피가 축적의 목 및 결과의 주요 혈관을 손상시킬 수 있으므로 가능하면 자궁 전위를 피하십시오. 그러나, 다른 기준 등 옥시토신의 혈중 수준과 같은 마우스에서 평가해야하는 경우, 다른 안락사 방법이 귀하의 IACUC에 의해 평가해야하지만, 필요할 수 있습니다. </li><li> 호일에 싸여 폴리스티렌 거품에, 그 뒷면에 마우스를 놓고 사지를 확산. 단단히 16-20 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 모든 사지를 핀. </li><li> 70 % 에탄올로 넉넉한 마우스를 스프레이. </li><li> 포셉를 사용하여 정중선에서 복부 피부를 끌어와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다. </li><li> 복부 또는 흉부 충치 (그림 1B)를 펑쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라. </li><li> &quot;Y 모양&quot;(그림 1B)에서 발생하는 정중선 절개로 앞 다리에 피부를 자르고. 후면 팔다리에 동일한 방법으로 (그림 1B)를 피부를 잘라. </li><li> 부드럽게 마우스의 측면에 복부 및 흉부 피부 껍질, hemostatic 집게를 사용하여. 필요한 경우, 부드럽게 결합하는 조직을 잘라. </li><li> 피부의 아래쪽에 연결된 내유 분비를 노출 16-20 게이지 바늘을 사용하여 폴리스티렌 거품으로 피부를 수정. 진행 및 시간 (그림 1C)에서 한쪽을 완료합니다. </li><li> 포셉를 사용하면 부드럽게 동물의 척추쪽으로 밖에서 시작 선 및 작은 날카로운 가위로 피부 사이에 관심의 유선를 들고 컷. 당신은 신중하게 절단 있는지 확인, 피부 또는 근육의 아무 조각이 선 (腺)에 남아하지 않도록. 모든 내유 분비 (그림 1)은이 프로토콜을 사용하여 제거하지만, 복부 내유 분비 (# 4) 전체 장착을위한 최고 수 있습니다. 2 층 및 3 차의 땀샘 일부 interdigitated 근육을 가지고 있으며 그들이 전체 마운트 및 조직학을 위해 사용할 수있는 반면, 그들은 모든 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. </li></ol> 2. 전체 마운트 <ol><li> 이전 해부에 하나 이상의 하루, 1리터의 Erlenmeyer 플라스크에 20 분 증류수와 종기 500 ML에 알루미늄 칼륨 황산의 카마인 및 2.5G의 1g을 용해하여 카르민 명반 솔루션을 준비합니다. 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정합니다. 왓먼 종이를 통해 필터와 방부제로 티몰 소량 (몇 가지 곡물)을 추가합니다. 냉동. 얼룩 후, 카르민 알룸 솔루션은 재고 병에 다시 붓​​고 수 있으며, 몇 주 동안 여러 번 재사용. 색상이 희미되면 새 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 마우스 (1 단계)에서 유선을 절개 후 유리 슬라이드에 직접 확산. 현장 모양의 원본을 유지, 가능한 한 그것을 버리고보십시오. 제대로 뻗어 때 선 (腺)이 멋지게 슬라이드 막대합니다. </li><li> 병 속에 상온에서 퓸 후드 4 시간, Carnoy의 정착액 (6시 3분 1초 백퍼센트 EtOH, 클로로포름, 빙초산)에, 슬라이드에, 그것을 immersing하여 선 (腺)을 수정. 다른 사람들이 충분한 것으로 보인다 2 시간 사용했을 있습니다. 또는, 분비는 4 ° C 하룻밤에 해결할 수 있습니다. </li><li> 15 분 70 %의 에탄올로 씻으십시오. 그런 다음, 항아리에서 에탄올 솔루션의 절반을 제거하고 ddH 2 O.로 교체하여 물 속에서 점차 rehydrate 5 분 알을 품다. 3 회 반복합니다. 오분 각 에탄올과 물을 욕조 - 35 % - - 15 % 또는 70 %를 사용합니다. </li><li> 5 분 증류수로 씻어. </li><li> 실온에서 하룻밤 카르민 명반에 얼룩. 그것은 얼룩이 선 (腺)의 두께에 따라 더 오래 걸릴 수도 있다고 지적한다. </li><li> 재사용 및 점진적으로 각과 크실렌에 명확이나 조직을 명확하고 무독성 대안 5 분 시리얼 에탄올 욕조 (50 % 70 %, 95 %, 100 %)를 통해 스테인드 조직을 탈수 얼룩 카르민 명반 제거 하룻밤. 탈수 및 삭제 모두는 두꺼운 샘플 더 이상 incubations 필요할 수 있습니다. </li><li> 메틸 살리실산에 담가 유선. 이미지 촬영 준비가 될 때까지 내유 분비가 퓸 후드에 메틸 살리실산에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 이미지는 조명 테이블에 슬라이드를 삽입하여 삼각대 ( &quot;매크로&quot;기능 사용 가능한 경우 사용)에 위치 일반 디지털 카메라와 퓸 후드에서 촬영하실 수 있습니다. 높은 배율의 해부 현미경을 사용합니다. 또는, 내유 분비는 사진이 충분히 얇은있는 마운트를 제공하는 이미징 플랫폼에서 화학 퓸 후드 밖으로 이동하는 수 (단계 2.7 이후) 등 Permount과 같은 매체에서 설치할 수 있습니다. </li><li> 전체 마운트, 같은 관의 부분을 따라 파급 효과의 숫자 (또는 측면 가지), 기본 관의 길이, 또는 지방 조직 영역 상피의 비율로 측정 평가 수를 사용하여 유선 개발을 계량하기 위하여. 마지막 사진 documen 후tation, 유선의 전체 탑재는 sectioning 및 일반 histological 얼룩을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다. </li></ol> 3. 옥시토신 - 유도의 우유 방출 <ol><li> 그들이 방송되었습니다 직후 댐에서 새끼를 구분한다. 분석을 수행하기 전에 1 시간 기다립니다. </li><li> 어머니를 희생과 동물에서 그들을 제거하지 않고, (단계 1.1-1.8) 이전과 설명 내유 분비를 노출. </li><li> 고르게 전송 피펫을 사용하여, 직접 관심있는 유선에 PBS 또는 옥시토신 솔루션 중 하나를 드롭하여 분석을 시작합니다. 복용의 큰 스펙트럼을 사용할 수 있습니다; ~ 8 PG / ML (생리 선량)이 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 높은 비 생리 복용은 (최대 1 MG / ML) 유전자 변형 마우스 모델에서 응답의 부재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차에 대한, 그것은 우유 방출 (옥시토신 노출)을 테스트하는 컨트롤 (PBS에 노출)과 반대편으로 한쪽을 사용하여, 흉부 (# 2-3) 분비를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 1 분 품어 조심스럽게 전송 피펫으로 aspirating하여 솔루션을 제거합니다. 덕트에 우유 항목은 비디오 테이프 녹화에 의해, 또는 PBS 또는 옥시토신 노출 전후의 이미지를 복용하여 모니터링할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 좋은 전체 마운트에서 유선이 멋지게 확산되고 상피의 덕트를 쉽게 (그림 2A) 관찰할 수 있습니다. 선이 잘 확산되지 않는 경우 정착액 솔루션에 배치하면, 그것은 슬라이드의 일부 또는 완전히 들어올려 수 있습니다. 선 다음 (그림 2B) 하드 및 사용할 수 없게 될 것입니다. 마찬가지로, 선 (腺)이 잘 해부하지 않으면, 상피의 일부 중 하나는 피부 또는 복부 근육의 일부가 누락 (그림 2C) 또는 잔여 수있는 것은 선 (腺)의 분석 (그림 2D)에 방해가됩니다. 옥시토신의 분석을 위해, 모든 경우에 시간의 동일한 금액을위한 댐에서 서클링 새끼를 분리하는 것이 중요합니다. 이러한 방법으로, 당신은 우유 또는 우유 소량 사전 옥시토신 노출에 환기구 안에 존재하지 않습니다되었는지 확인합니다뿐만 아니라, 충분한 우유 myoepithelial 수축 (그림 3A)의 덕트로 꺼낼 수있는 폐포에 존재 . 새끼가 너무 빨리 제거하는 경우, 우유는 폐포와 (그림 3B) 모니터 어려운 옥시토신의 효과를 렌더링 덕트에 누적될 수 있습니다. 실험이 강아지 제거 후 너무 빨리 수행하는 경우 또는, 우유 (그림 3C) 관찰하기 위해 덕트에 충분한 우유 릴리스가 실행되지 않습니다 폐포와 myoepithelial 세포의 옥시토신 유도된 수축으로 축적 시간이 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 마우스 유선의 해부. 사지 (A)하여 뒷면에있는 마우스를 핀. 배꼽에서 목을 먼저 피부를 잘라. 다음과 같이 점선 (B)에 의해 표시되는 각 사지에 배꼽의 중심에서 수직 incisions합니다. 부드럽게 껍질 동물의 측면에있는 피부와 내유 선들 (C)를 노출, 그것을 핀. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 마우스 유선의 전체 탑재. 상피 구멍 (화살표)과 림프절 (화살촉)는 ​​쉽게 선 (腺)의 정중하게 확산 유선 전체 마운트 # 4에서 관찰 (A). 아르 제대로 확산 유선은 슬라이드에서 분리하고 그것을 사용할 수 없게 렌더링 붕괴 (B). 될 수 있습니다 부적 절한 excised 유선도 (D) 나머지 누락된 부분 (C) 또는 근육이나 피부 조각을 가질 수 있습니다. 2 차, 3 차의 땀샘은 근육을 interdigitated지만, 여전히 전체 마운트 또는 조직학 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 옥시토신 유발 우유 분출이 옥시토신 노출 (A) 다음 (화살표) 상피 관에서 볼 수 있습니다. 그러나, 덕트가 이미 새끼, 옥시토신 노출 후 덕트에 우유가 더 축적 (화살표)의 서클링 마지막 이후 대기의 부적절 긴 기간에 의한 분석의 시작 부분에 우유 (화살표)로 가득있다면 어려운 관찰 (B). 또는, 강아지 서클링 후 짧은 잠복기가 제대로 옥시토신 노출 (C) 후 덕트 (화살표)에서 관찰되는 폐포에 우유 충분히 축적을 허용하지 않습니다. 이미지는 숫자 카메라 (Cyber​​shot 소니)를 사용하여 옥시토신 노출 전후에 찍은. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 전체 설치 및 옥시토신 치료 assays의 도식 표현.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

유선의 발달과 기능을 긴밀하게 조정됩니다. 돌연변이 마우스는 글랜드 아키텍처 13,12을 평가할 필요성을 강조 유선 개발과 기능에 악영향을 줄 수있는 유전자 변이를 항구 수 있습니다. 유선 개발의 모든 단계에이 문서에 설명된대로 전체 설치는 수행할 수 있습니다. 일반적으로 상피의 개발은 사춘기 (~ 6 주 이내)의 중간에와 2,10 사춘기 (~ 10-12주 이전) 이후, 사춘기 (~ 4 주)의 시...

evaluation of mammary gland development and function in mouse models

인간의 유선은 15-20 엽 (叶)으로 구성되어 있습니다 유두에서 분기 덕트 시스템 오픈에 분비되는 우유. 자체 분비의 폐포 및 수렴 덕트 1 만들어진 단자 덕트 소엽 단위의 다수의 사람 엽 (叶)을 구성하고 있습니다. 마우스에서 유사한 구조는 덕트와 폐포가 결합 조직 기질 내에 interspersed있는 임신에서 관찰됩니다. 마우스 유선의 상피는 세포의 두 레이어, 지하 막 2의 경계으로 표시 myoepithelial 세포의 외부 층으로 둘러싸인 luminal 세포의 내부 레이어로 구성된 관의 시스템과 같은 나무입니다. 출생에서 단 rudimental ductal 나무는 기본 덕트와 15-20 가지로 구성되어, 현재입니다. 호르몬 3,4,5의 영향하에 주변 4 주 사춘기의 시작 부분에 지사 연신율 및 증폭 시작. 10주에서 기질의 대부분은 임신이 때까지 각 estrous주기 분기와 회귀의주기를 받게 될 것이다 덕트의 복잡한 시스템에 의해 침략입니다. 임신의 시작에서 개발의 두 번째 단계는 폐포 6,7 불리는 포도 모양의 우유 분비 구조를 형성하는 상피의 증식과 분화와 함께 시작됩니다. 출산과 젖 분비를 통해 다음, 우유는 luminal 분비 세포에 의해 생산되고 폐포의 루멘 내에 저장됩니다. 여우 서클링에 의해 유도된 신경 반사에 의해 자극 옥시토신 릴리스는, 우유는 그것이 새끼 8 사용할 수있게됩니다 젖꼭지에 덕트를 통해 이송 수 있도록, 폐포 주위와 덕트 따라 myoepithelial 세포의 동기 수축을 유도. 유선 개발, 분화 및 기능을 긴밀하게 조정하고 요구 기질과 상피 사이뿐만 아니라 상호 작용뿐만 아니라 상피 9,10,11 이내 myoepithelial과 luminal 세포 사이에 있습니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 연루 많은 유전자에 돌연변이 늦은 임신과 젖 분비 12,13 이어지는 분비 활성화하는 동안 임신 초기, 분화 동안 사춘기 또는 폐포 형성 중에 하나 ductal 신장을 손상 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 마우스 내유 분비를 해부하다하고 전체 마운트를 사용하여 개발을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 전 생체내 옥시토신 기반 기능 분석을 사용하여 myoepithelial 수축과 우유 방출을 평가하는 방법을 보여줍니다. 유선 개발 및 기능에 유전자 돌연변이의 효과는 따라서 돌연변이와 야생 형 컨트롤 마우스에서이 두 기법을 수행하여 현장에서 확인할 수 있습니다.

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Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.1K 조회수.  University of Western Ontario. 이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

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In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

연구

생물학

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...