Las propiedades mecánicas de las células vegetales son esenciales a tener en cuenta al tratar de entender los mecanismos subyacentes al desarrollo. La microscopía de fuerza atómica se puede utilizar para medir estas propiedades, y seguir la forma en que cambian, entre órganos, tejidos, todas las etapas del desarrollo. Las principales ventajas de esta técnica, es que no es invasiva, es relativamente rápida y no requiere tratamiento por lo que se puede aplicar directamente a muestras vivas.
Para alguien que es nuevo en este procedimiento, la sección cis de la muestra es realmente crítica, así que asegúrese de que realmente tiene la fijación mecánica adecuada de la muestra. La demostración visual de este procedimiento, es fundamental para comprender mejor las complejidades de la fijación de la muestra, el control de calidad de los fomentos y la configuración de la medición. Demostrando el procedimiento estarán Simone Bovio, una ingeniera y Yuchen Long, un post doc en mi laboratorio.
Para comenzar, coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en el centro de la placa de petri de cinco centímetros de diámetro. Añadir una muestra de genesium que se ha aislado de un brote de flor a la cinta. Agregue rápidamente agua al plato hasta que la muestra esté completamente cubierta para evitar la deshidratación.
A continuación, coloque la muestra en una etapa AFM y mueva la cabeza para que esté sobre la muestra. Después de haber calibrado el voladizo, en el software, asegúrese de que el sistema está en modo QI, y acercarse a la muestra con una fuerza de punto de ajuste de quince nano newtons. A continuación, establezca una longitud Z de cuatro micras y establezca el área de escaneo en ochenta por ochenta micras cuadradas con el número de píxeles establecido en cuarenta por cuarenta.
A continuación, vaya al panel de configuración de imágenes avanzadas y establezca el modo a velocidad constante. Además, establezca una extensión de las velocidades de entrada a doscientos micras por segundo, y la frecuencia de muestreo a veinticinco kilos de hercios. Una vez establecidos los parámetros, mueva la punta a la región de interés de la muestra.
Compruebe que el área a escanear está libre de escombros, localice una región lo más plana posible y enganche, luego comience el escaneo y utilice el escaneo rápido de baja fuerza para comprobar si la muestra se mueve. Una vez que un área de interés como se ha localizado, seleccione una región que sea cuarenta por cuarenta y sesenta por sesenta micras al cuadrado, y aumente el número de píxeles a dos píxeles por micra. A continuación, aumente el punto de ajuste a quinientos nano newtons, para obtener una sangría de cien a doscientos nano metros.
Disminuya la longitud Z a dos micras, y extienda las velocidades del tracto de entrada a cien micras por segundo, luego aumente la frecuencia de muestreo a cincuenta kilohercios y comience a escanear la muestra. Cuando haya terminado, guarde la salida como una imagen y un archivo de datos. Abra el software de procesamiento de datos y cargue el archivo de datos.
Haga clic en el botón Usar este mapa para el procesamiento por lotes para utilizar los mismos parámetros en todas las curvas del mapa, luego vaya a cargar el proceso predefinido y seleccione el ajuste de hercios. A continuación, vaya a la operación de línea base conmutable y establezca restar en desplazamiento más inclinación, y X min entre cuarenta y sesenta por ciento. En la pestaña de posición de la punta vertical, seleccione un ajuste suave y ajustado, si prefiere trabajar en datos sin procesar.
Para seleccionar el modelo de ajuste adecuado, vaya a la pestaña ajuste de elasticidad y seleccione una de las opciones en función de la resistencia de adhesión esperada. Si no hay o la adhesión débil está presente, entonces utilice la curva de aproximación y prefiera utilizar el modelo de isnader de hercios. En caso de adherencia más fuerte, utilice el modelo de Dergen Milia Dortoprov o DMD y trabaje en una curva retardada.
Ahora establezca los parámetros geométricos de la punta en función de la forma nominal de la punta. La punta utilizada en este experimento es una punta esférica, con un radio de cuatrocientos nano metros. A continuación, establezca la relación Poisson en 0,5 y seleccione curvas de desplazamiento.
Agregue una segunda rutina de ajuste de elasticidad, haciendo clic en el icono junto a la ventana principal, y repita la misma configuración de parámetros. Por último, especifique la sangría deseada en X min y, a continuación, mantenga y aplique a todos para iterar los pasos anteriores en todas las curvas del mapa. Guarde los resultados para obtener una imagen en un archivo tsv de punto.
Para medir con cambios rápidos de solución, monte una muestra en una placa de petri, sosteniendo un pequeño trozo de masilla adhesiva. Selle rápidamente el espacio entre la masilla y la base de la muestra con pegamento biocompatible. Espere a que el pegamento se solidifique y luego sumerja la muestra en un medio de cultivo de ápice líquido, que contiene 0.1 por ciento de mezcla de conservación vegetal.
Después de calibrar el sistema, abra el software de adquisición y vaya primero a la ventana de parámetros de verificación. Allí se establece la constante de resorte en la constante de resorte fabricada del voladizo o en la constante de resorte determinada. A continuación, establezca el radio de la punta en cuatrocientos nano metros, la relación de poisson de la muestra en 0,5, la línea de muestreo en ciento veintiocho para garantizar una adquisición rápida, la velocidad de escaneo a 0,2 hercios y el tamaño de escaneado a un micrón.
A continuación, vaya a la ventana de rampa y establezca el tamaño de la rampa en cinco micras, el umbral de trig al máximo, y el número de muestras a cuatro mil seiscientos ocho. Con todos los parámetros establecidos, acérquese cuidadosamente a la muestra manualmente. Cuando el sondeo esté relativamente cerca de la superficie de la muestra, haga clic en enfoque.
Al ponerse en contacto, aumente gradualmente el tamaño del escaneo y modifique la velocidad de escaneo, hasta que se alcance el equilibrio deseado sin dañar la muestra o la punta. Reubique el análisis si la región de medición no es la deseada. Cuando esté satisfecho, haga clic en el botón, apunte y dispare, para iniciar el punto y la ventana de disparo.
Especifique un directorio de guardado y un nombre de archivo. A continuación, haga clic en la rampa en el siguiente escaneo para iniciar la grabación. Una vez finalizada la exploración, la interfaz del software redirigirá a la ventana de rampa.
Haga clic en la imagen escaneada para especificar las posiciones que se va a aplicar sangría. Elija al menos tres vistas de sangría por celda cerca de su centro de bayas, establézte para repetir la sangría tres veces por lado y, a continuación, haga clic en rampa y captura. En el software de análisis, abra el archivo MCA de punto, esto muestra la posición de cada curva de fuerza en la imagen escaneada.
A continuación, abra una curva de fuerza para analizarla. Haga clic en el botón de corrección de línea base y arrastre las líneas de guión azules en la curva de fuerza, hasta extender el inicio de la línea base de origen y extender el tope de la línea base de origen, o al 0 por ciento y al 80 por ciento, respectivamente. A continuación, haga clic en ejecutar.
A continuación, haga clic en el botón de filtro de coche de caja y haga clic en ejecutar para suavizar la curva de fuerza. A continuación, haga clic en el botón de sangría. En la ventana de entrada, establezca la curva activa para extender, el quinto método en el modelo linealizado, el límite de ajuste de fuerza máximo en 99 por ciento, el límite de ajuste de fuerza mínima en 75 por ciento y el modelo de ajuste a rigidez.
Analice las curvas de fuerza en un lote. Para ello, haga clic en el botón Historial de ejecución, especifique el directorio de informes y agregue otras curvas de fuerza que requieran el mismo tratamiento. Cuando haya terminado, haga clic en Ejecutar.
Cuando el valor de K se ajusta por lotes, haga clic en el historial y vaya a cinco sangrías para volver a la ventana de sangría. Una vez allí, cambie el límite de ajuste de fuerza máximo al diez por ciento y el límite de ajuste de fuerza mínimo al uno por ciento. A continuación, establezca el modelo de ajuste en hertziano.
A continuación, abra el archivo adecuado para mostrar los diferentes canales escaneados. En la ventana de canal alto, haga clic en el botón de sección. Esto permitirá la medición de la curvatura de la superficie de la muestra que se requiere para la deducción de presión de turgor.
A continuación, dibuje una línea a través del eje largo de una celda, mueva los límites de la línea de guión a los bordes de la celda y registre el valor de radio. Finalmente siga el protocolo de texto, para calcular el módulo de la joven media, la constante de resorte, E, K, y la presión del turrón para cada célula. La imagen de la izquierda es un mapa del módulo de los jóvenes, obtenido mediante el análisis de toda la sangría hasta el punto de ajuste de fuerza definido por el usuario, mientras que la imagen de la derecha, muestra el resultado del análisis de los primeros cien nano metros de sangría.
Aquí, los dos mapas se ven muy similares sin embargo, la variación de la profundidad de sangría puede llevar en algunos casos a resaltar mejor las heterogenetiitudes de la muestra, lo que puede ser útil para identificar la ubicación o para proporcionar información sobre el comportamiento de las estructuras internas. Para cada punto de estos mapas, hay una curva de fuerza subyacente. La curva que se muestra aquí, tiene dos efectos que vale la pena mencionar.
En primer lugar, si la parte de aproximación de la curva de fuerza termina en quinientos nano newtons. El movimiento de la punta hacia abajo sigue adelante. Lo que significa que la fuerza final aplicada por la punta es mayor de lo esperado.
La segunda cosa a notar, es la onda en la curva retraída resaltada por la elipse. Tal agitación puede ser un indicador de movimiento de la muestra o vibración bajo la acción de la punta y puede ser necesario cambiar a un método de fijación diferente. Mediante el procedimiento documentado en este artículo, todos los parámetros clave para una deducción de presión de turgor, excepto el espesor de la pared celular, se pueden recuperar de los escaneos y hendiduras de AFM.
La curva de fuerza de la sangría profunda en la posición de la cruz roja describe el módulo del joven de la pared celular y la rigidez aparente de la muestra en diferentes regímenes de la curva. La fijación de la muestra es crucial. Durante el proceso de medición, preste atención a los signos de inestabilidad de la muestra.
Elija cuidadosamente una región con superficie plana para garantizar una sangría perpendicular. Siguiendo este procedimiento, se pueden monitorear las propiedades mecánicas a lo largo del tiempo y diferentes condiciones. También se pueden superponer mediciones mecánicas con imágenes confocales para estudios correlativos.
Esta técnica allana el camino para vincular la biomecánica con el desarrollo de la fisiología y otros procesos biológicos.
