Este trabajo ha sido financiado en parte por subvenciones del NIH, R44 GM087784 y R01 HL109505. Autores gracias al equipo técnico y OEM en Gilson, INC para el soporte técnico ampliado.

Los autores MKC, MJG, EEB, NJD y RO son o fueron en el momento de empleados de desarrollo de InvivoSciences, INC que concibieron y desarrollaron los protocolos robóticos que se describen aquí. TW es el PEP para InvivoSciences INC. SH es un empleado de Gilson INC.

En el presente estudio se desarrolló un método de cultivo para la producción robotizada IPSC que miniaturiza y automatiza la alimentación y el pasaje en un formato de placa de 96 pocillos a la vez que permite eficiente escala hacia arriba. Un robot de manejo de líquidos se usó para alimentar rutinariamente colonias IPSC y el paso a intervalos regulares por disociación enzimática. El robot también se programó para producir placas recubiertas de gel de matriz extracelular y llevar a cabo un gradiente de densidad de siembra. Cuando fibroblastos y células iPS derivadas de tejido adiposo se cultivaron en este sistema durante más de 20 pasajes, unos 3 meses, se mantuvo la pluripotencia, como lo fueron cariotipos estables. Ambas líneas celulares fueron capaces de diferenciación en cardiomiocitos. En conjunto, la colección de protocolos descritos aquí permite a los usuarios con muy poca experiencia en cultivo de células madre, o acceso limitado a la cultura equipo especializado, a las células madre de la cultura y lograr la producción de células de alta o manejar con mano de obra y el costo mínimo de varias líneas. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Los protocolos robóticos se detallan aquí proporcionan un método para la escala económica de producción y manejo de IPSC. Una de las ventajas es la cultura de células madre escalable en un formato basado en la placa establecida demostrado aquí y previamente 44,47 - 49 para mantener la pluripotencia. Mientras que otros formatos de células pluripotentes escalable rendimiento cultivo de células madre 20,23,29 método basado esta placa requiere esencialmente ningún cambio en el formato de la cultura, como la adaptación a la suspensión, el uso de antiespumantes químicos o el uso prolongado de Rho-kinasa inhibidor 20. Este método de la placa basada puede, por tanto, rápidamente, y como era previsible, acomodar nuevas líneas porque las condiciones de cultivo son similares. Como el uso de CMPI para el modelado de la enfermedad aumenta 4,6,19,50, nuevas líneas de IPSC se generan continuamente. Las técnicas descritas aquí son los más adecuados a la cultura nueva líneas en medio a alto volumen y el rendimiento debido a la barrera de la transición hacia el formato es lujo. Esto también es cierto para la mano de obra y equipo necesario para mantener las colonias. Finalmente, debido a que el formato y la manipulación son similares para el medio ambiente utilizado para deducir y validar las líneas de IPSC, el rendimiento cultura, tales como diferenciación dirigida, es probable que sea más predecible. La Figura 8 ilustra una estrategia para la escala de producción de células madre en placas de 96 pocillos. Una placa (ciclo 0) se utiliza para sembrar robóticamente 12 nuevas placas, un aumento de 12 veces (Ciclo 0 a 1). Después de varios días de alimentación, uno de los doce placas es pasado para sembrar otro conjunto de doce placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Las placas once restantes están ahora disponibles para otros usos y representan la componente de producción del sistema. A este ritmo, el paso de una placa proporcionará 11 placas cada ciclo, o cada 3-4 días. Esta metodología se puede escalar más cuando múltiples placas se pasan como se muestra en la transición del Ciclo 2 Ciclo a 3. En el Ciclo 3, dos placas sonsiempre se utiliza para mantener la colonia y sembrar 24 nuevas placas. Las 22 placas restantes estarán disponibles para su uso después de cada ciclo de pasaje. En cualquier punto en el ciclo de mantenimiento el usuario puede sembrar más placas para aumentar la producción. Un ejemplo sería la de pasaje cada columna para dos ciclos de crecimiento. El primer pasaje convierte una placa en doce placas, y cada uno de los doce placas se utiliza para sembrar 144 placas. En este caso, un usuario comienza con una placa y después de dos pasajes, o alrededor de 1,5-2 semanas de cultivo, tiene 144 placas. Por ejemplo, los fibroblastos y adiposo IPSC líneas de fluencia de aproximadamente 25-75 million células por placa de 96 pocillos cuando esté listo para pasaje. Por lo tanto, 144 placas podrían representar cerca de 4-7 x 10 9 células. ¿Cuál es la carga de trabajo para la realización de 144 placas de 96 pocillos robot? Uno de los objetivos de este trabajo fue la producción de células madre escalable que reduce la mano de obra en comparación con (placa es decir, de 6 pocillos) tradicional de cultivo de células madre. El robot accomplishes esta aliviando la necesidad de manejar físicamente cada placa durante la alimentación y pases. Mientras que las escalas de producción de placas de 96 pocillos linealmente como sería en placas de 6 pocillos tradicionales, el tiempo de un técnico pasa a trabajar con las placas es significativamente menor uso de la cultura robótica. La eficiencia de la producción de la cultura robótico se deriva de esta diferencia (Figura 9). Se encontró técnicos podrían eliminar una placa de 6 pocillos de la incubadora, comprobarlo en el microscopio, y luego aspirar y alimentar la placa en aproximadamente 3,5 minutos. En comparación, los técnicos pasan aproximadamente 30 sec la eliminación de una placa de 96 pocillos de la incubadora y la inspección en el microscopio para la densidad y la contaminación antes de colocarlo en el robot. Con un protocolo de alimentación ampliado similar a la descrita anteriormente, seis placas de 96 pocillos se pueden cargar y alimentado, que dura aproximadamente 21 min, o 3,5 min por placa. El tiempo total transcurrido para alimentar una placa es comparable entre el robotSe requiere ic y métodos manuales, pero a alimentar a mano 6 placas de un técnico para los 21 minutos, mientras que el técnico gasta sólo 3 min manejo de las seis placas para el robot (una inspección de 30 segundos por placa). Como figura 9 muestra, el tiempo de un técnico pasa el manejo de 144 placas utilizando el robot es alrededor de 1,2 horas en comparación con 8 horas de forma manual y el robot nunca cometer un error de manipulación de las placas o la transferencia de líquidos. Los 96 pozos métodos de cultivo IPSC descritos aquí proporcionan una plataforma manejable para las tareas de detección de complejos. Debido a que cada pozo es genéticamente idéntica y sin semillas a la misma densidad de la misma agrupación inicial, las variables pueden ser distribuidos a través de la placa y mantenidos por el robot con depósitos disponibles en el mercado para segregar condiciones. Esto sería útil para los experimentos tales como el crecimiento de células madre desarrollo de los medios 34,35,47, pruebas de sustrato o condición de cultivo y los estudios de toxicidad que utilizan células madre51. Dado que cada línea de células madre es único en términos de requisitos óptimos tamaño de las colonias y de paso, se puede utilizar este sistema para modular la densidad de siembra, la frecuencia de la alimentación y el manejo paso por la manipulación de las columnas cosechados, la agitación mecánica durante el paso y la frecuencia de alimentación. Iteración a través de estas variables permitirá al usuario encontrar rápidamente un conjunto de condiciones adecuadas para el cultivo de una nueva línea o desarrollar nuevas técnicas de cultivo. El sistema robótico también es capaz de mantener 96 colonias de células madre paralelas pero independientes. Cuando IPSC se derivan de células somáticas o clonado después de la manipulación genética, muchos clones paralelas son examinados para producir potenciales líneas de IPSC. Una vez que las células individuales se siembran en placas de 96 pocillos, este sistema puede alimentar y de paso de las placas de 96 pocillos de mantenimiento de cada colonia separado. Esto permite un rendimiento muy alto cuando la selección de clones potenciales y elimina la dificultad en el cultivo físicamente 96 líneas paralelas. Este método también unallows ampliarse producción de cada clon para que el material está fácilmente disponible para el análisis paralelo. Finalmente, prevemos la integración de estas técnicas de cultivo con un sistema de tráfico de placa robótico que entrega a placas de la incubadora y permitiendo cultura totalmente automatizado. Esto podría lograrse con la robótica más complejos que permiten una mayor expansión desde los protocolos básicos descritos aquí son transferibles a otros sistemas basados ​​en placa. Los primeros pasos críticos para abordar en los protocolos son los que previenen y comprobar la contaminación como los pasos 1.5 y 4.2. La contaminación, como se discutió anteriormente, se puede evitar con éxito si se utilizan buena técnica estéril y el sentido común. Es imprescindible, independientemente del formato cultivo de células madre, que el cheque del operador de contaminación y haciendo lo que en este protocolo en los pasos indicados reducirá significativamente el riesgo de contaminación. La aplicación del gel matriz extracelular adecuada es una segunda esspaso cial para el éxito general de este protocolo. Sin recubrir adecuadamente las placas de 96 pocillos, las células madre no crecerán. Un tema común es el recubrimiento bien incompleta. La experiencia ha demostrado que las burbujas de aire, la atracción electrostática y la acción capilar dificultar el revestimiento bien completa. La etapa de pre-humectación (1.6) fue desarrollado para mejorar significativamente recubrimiento pocillos de fondo y no debe ser omitido. Este paso pre-humectación parece reducir la aparente hidrofobicidad de la placa de 96 pocillos de plástico de tal manera que cuando se aplica el recubrimiento de gel de la matriz extracelular se distribuye uniformemente a través de la parte inferior y lados bien. También se recomienda para golpear suavemente las placas de 96 pocillos contra una mano limpia una vez recubierto para asegurar la distribución solución de gel de matriz extracelular, incluso. Los parámetros de disociación también son importantes para optimizar. Incubación extendida con la enzima o reactivo de disociación basada EDTA resultará en células individuales que pueden o no ser el objetivo durante el paso. Por lo tanto, el operadordebe prestar especial atención a cómo el tiempo de disociación, la fuerza de trituración, y las repeticiones de lavado afectan a la morfología de la colonia y la salud y ajustar en consecuencia. La comprensión de las limitaciones de las técnicas descritas aquí son de suma importancia para la operación exitosa. Como en cualquier otro entorno de cultivo celular, el uso de placas de 96 pocillos presenta un riesgo relativamente alto de contaminación. Como se describió anteriormente, un técnico es el manejo de cada placa durante la alimentación y pases; por ejemplo, al abrir la tapa, poner la placa en la cama robot, y la comprobación de la placa en el microscopio. Por lo tanto, como se señaló después del paso 1.5, es imperativo no tocar el interior de cualquier plato o tapa exponer esta parte a cualquier superficie potencialmente contaminada, como los bloques de calentamiento inclinadas o clavijas verticales en la cama. Durante el desarrollo del protocolo de esta limitación fue descubierto y fue el impulso para desarrollar un estante para mantener las tapas de la placa para mantener la esterilidad. Del mismo modo, los embalses mínimas, puntas de pipeta y other suministros en la cama manejo robot líquido son fuentes potenciales de contaminación, ya que están abiertos al medio ambiente y manejado por el técnico. Por lo tanto, una buena técnica estéril se debe aplicar como la reducción de los movimientos de los materiales expuestos cultura o líquidos abiertos. Otra limitación es que cuando el protocolo se escala hacia arriba, comprobando visualmente cada pocillo de&gt; 100 placas de 96 pocillos es engorroso. Esto puede ser tratado por inspección visual de toda la placa en busca de signos de contaminación, tales como medios turbios, para identificar pozos sospechosas. Para futuro escala hacia arriba, se incorporará el uso de un microscopio automatizado y el indicador del crecimiento celular y la contaminación potencial. En resumen, el 96 pocillos plataforma basada alto rendimiento descrito aquí ofrece un método reproducible, de alta fidelidad para cultivo de células madre y la producción en un formato de placa. Este método reduce la experiencia necesaria, el equipo de tiempo necesario y el trabajo dedicado a frenar el cultivo de células, mientras queel mantenimiento de los beneficios de la cultura tradicional adherente.

El uso de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) ha aumentado significativamente desde su derivación en 2007 1 para el ensayo en recintos, la medicina regenerativa y la modelización de la enfermedad 2-6. Esta demanda viene de la capacidad de IPSC para producir grandes cantidades de células pluripotentes que pueden diferenciarse en células somáticas en una cantidad sin precedentes. Como técnicas de diferenciación dirigida mejoran 7 - 10 de y el desarrollo de célula humana o modelado de tejidos y terapia celular aumenta 11 - 14, también lo hace el requisito para la producción en masa de CMPI de alta calidad. Es ampliamente citado que, entre otras enfermedades, infarto de miocardio o la sustitución funcional de las células b requerirán cientos de millones a miles de millones de IPSC derivado células somáticas 15-18. Por otra parte, cada vez más complejos de modelado tejido 3D para el descubrimiento de fármacos y therapy exigirá un gran número de células 9,13,19. En todos estos ejemplos, definidos, uniformes y reproducibles iPSCs deben estar disponibles y sencillo de producir. Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. La producción en escala de CMPI se ha centrado en cultivo en suspensión 20 - 25 o suspensión con el uso de sustratos microportadores 26-28 en parte debido a que estas técnicas se implementan con éxito para gran escala, no IPSC, la producción basada eucariota. Varios grupos han demostrado los sistemas de cultivo en suspensión que producen las células madre pluripotentes 20,21,23,24,29. Sin embargo, estos enfoques utilizan sistemas caros y complejos no están fácilmente disponibles para los investigadores que desarrollan programas de diferenciación nuevos, conduciendo la ingeniería de tejidos y haciendo laboratinvestigaciones a escala de ORY. Por otra parte, las culturas IPSC suspensión y microportadoras requieren adaptación y técnicas o productos químicos que no se encuentran en la cultura tradicional adherente IPSC como el uso continuo de inhibidor de Rho-quinasa, agentes antiespumantes y filtración para regular la agregación. El estrés físico a las células es más frecuente en cultivo en suspensión, introducida por agitación mecánica, así como durante la colisión microsoporte. Estos problemas limitan la previsibilidad y la velocidad a la que se acaba de generar líneas de células madre pueden cultivarse en suspensión. Otros han desarrollado sistemas de manipulación de placas robóticos que imitan las técnicas de cultivo en placa de 30,31 pero estas plataformas exigir inversiones significativas para el equipo y experiencia para operar en Además de los retos fundamentales asociados con cultivo de células madre. El siguiente trabajo describe el desarrollo y la práctica de un sistema de cultivo IPSC escalable que utiliza un líquido robótico de 8 canales estándar autónomocontrolador y placas de 96 pocillos. Este método fue diseñado para salvar la cultura IPSC escala de laboratorio y de alto volumen de producción IPSC (por ejemplo, 10 7-1,5 x 10 9 células por semana por técnico) que permitan a los que desarrollan nuevas tecnologías IPSC escalar fácilmente hasta la producción sin grandes inversiones en hardware o laborales. Este método es relativamente barato de instalar, requiere poca o ninguna experiencia cultivo de células madre, programación o ingeniería, tiene una pequeña huella de equipo sin la necesidad de una campana de cultivo celular dedicado, y utiliza el equipo de cultivo celular estándar para permitir a mediano y alto rendimiento automatizado la producción de células. El objetivo era desarrollar un sistema capaz de cultivo de células madre escalable que puede ser utilizado por los laboratorios nuevos para frenar el cultivo de células, los que se encuentran el cultivo manual de una barrera para el desarrollo de sus ideas o aquellos que quieran un medio económico para producir un gran número de células madre. La plataforma presenta aquí elimina la influencia técnico enmadre de cultivo de células y normaliza los procedimientos de alimentación y de paso para permitir la producción de células madre consistente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

El avance continuado en el cultivo de células madre pluripotentes se está cerrando la brecha entre la banca y de noche para el uso de estas células en la medicina regenerativa, el descubrimiento de fármacos y pruebas de seguridad. Con el fin de producir vástago Biofarmacéutica celulares derivadas de células y para la ingeniería de tejidos y el trasplante, una tecnología celular fabricación rentable es esencial. Mantenimiento de la pluripotencia y un rendimiento estable de células en aplicaciones posteriores (por ejemplo, la diferenciación celular) con el tiempo es de suma importancia para la producción de células a gran escala. Sin embargo, eso puede ser difícil de conseguir, especialmente si las células se cultivan de forma manual en el que el operador puede introducir variabilidad significativa, así como ser prohibitivo para escalar en marcha. Para habilitar de alto rendimiento, en gran escala la producción de células madre y quitar protocolos de cultivo de células madre novela influencia operador utilizando un sobremesa multicanal robot de manejo de líquido fueron desarrollados que requieren la participación de técnicos mínimos o experiencia. Conestas células madre pluripotentes inducidas protocolos humanos (iPSCs) se cultivaron en condiciones libres de alimentador directamente de una acción congelada y se mantuvieron en placas de 96 pocillos. Dependiendo de la línea celular y la tasa de escalado deseado, el operador puede determinar fácilmente cuando a paso basado en una serie de imágenes que muestran las densidades de colonias óptimas para la división. A continuación, los reactivos necesarios están preparados para llevar a cabo una división colonia a nuevas placas sin una etapa de centrifugación. Después de 20 pasajes (~ 3 meses), dos líneas de IPSC mantienen estables cariotipos, expresan marcadores de células madre, y diferenciarse en cardiomiocitos con alta eficiencia. El sistema puede realizar cribado de alto rendimiento subsiguiente de nuevos protocolos de diferenciación o la manipulación genética diseñados para placas de 96 pocillos. Esta tecnología reducirá la carga de trabajo y técnica para producir grandes cantidades de células madre idénticas para una miríada de aplicaciones.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Escalable 96 pocillos Placa base IPSC Cultura y Producción Usando un sistema de manipulación robótica Líquido

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K vistas.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

La encapsulación de alginato de células madre pluripotentes utilizando una boquilla-Co axial

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo para realizar la migración de células / Curación de Heridas en una placa de 96 pocillos

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Alimentador-libre las condiciones de cultivo para la generación de humanos derivados de iPSC de modelos de celulares de retina y definido sin Xeno

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...